MALDI-TOF ICMS: avanços na identificação de fungos

Abstract

O sistema mais antigo pam a classificação das espécies de fungos, que incluem fungos filamentosos e levedums, são baseados em dados morfulógicos, principalmente naqueles ligados às estrutums reprodutivas. No entanto, este método de classificação apresenta limitações criticas, tais como as cultums de fungos que não desenvolvem estrutums reprodutivas, ou a semelbança morfológica entre membros de espécies diferentes. A incorpomção de testes bioquímicos e moleculares em taxonomia de fungos tem ajudado a resolver esses problemas. Apesar destes avanços as principais limitações situam""e por (I) os testes fisiológicos rápidos e fiáveis e os dados das sequências estão disponíveis ainda apenas pam um número limitado de taxa; (2) a aplicação de métodos moleculares à rotina é relativamente caro e exige mão-de-obm altamente especializada; (3) apresentam atmsos na identificação (que em alguns casos pode ser de semanas) bem como limites na discriminação de espécies relacionadas. A espectrometria de massa, pela técnica de MALDI-TOF ICMS, tem sido usada como uma abordagem fenotípica pam a identificação rápida de fungos. Quando aplicada à identificação de fungos, esta técnica está fundamentada na análise das proteínas constituintes das células microbianas intactas, onde o espectro de massa das proteínas é gemdo e interpretado como um fingerprint celular. Pam tal, uma pequena quantidade da amostm do material biológico - cerca de 50 J!g de biomassa - é tmnsferida directamente da placa de cu! tum pam a placa de MALDI-TOF e recoberta por uma matriz orgãnica em solução aquosa e acidificada. A acidez desta solução é fundamental pam uma extmcção proteica óptima. Depois de evapomda a tàse líquida, obtém-se um material cristalizado, necessário à ionização das moléculas. As amostms são, então, submetidas a um sistema de vácuo e irmdiadas por um laser pulsado de nitrogénio a 337 um. Esta irmdiação conduz à ionização suave das moléculas, onde a matriz orgãnica previne a fragmentação molecular. A nuvem de iões gemda dumnte a ionização é acelemda pam dentro do tubo "TOF', onde esses iões são sepamdos de acordo com os seus tempos de voos individuais. O tempo de voo de cada ião ocorre em função da mzão massa/carga (m/z) e os espectros finais são obtidos numa escala de 2 a 20 kDa. Finalmente, esses espectros são tmtados numa base de dados contendo espectros teóricos e experimentais pam as diferentes espécies de fungos. A presente técnica é bastante robusta na identificação de fungos até ao nível de espécie. Contudo, em alguns casos, é possível a diferenciação desses microrganismos até ao nível de estirpe. No presente tmbalbo serão apresentados os últimos avanços sobre a técnica de MALDI-TOF aplicada à identificação de fungos, desenvolvidos na Micoteca da Universidade do Minho (www.micoteca.deb.uminbo.pt).