Paracoccidioides brasiliensis: virulence factors and host susceptibility

Abstract

In the last decades, significant advances were accomplished on the study of neglected fungal diseases, mainly in defining the pathogen genetics and host risk factors. Paracoccidioidomycosis, a mycosis caused by Paracoccidioides species, is one of these diseases, and it is estimated to affect 10 million individuals in countries from Latin America. Over the last years, genomic and transcriptome studies on this fungus raised important questions, especially on the consequences that the multinucleated nature and morphological heterogeneity of Paracoccidioides brasiliensis can have on triggering host defence mechanisms. However, these aspects were never addressed. Moreover, the lack of efficient molecular tools to further explore P. brasiliensis has been hindering the identification of genetic factors that govern virulence and the polymorphic nature of the yeast pathogenic phase, as well as the mechanisms underlying its dimorphic behaviour. The highly heterogeneous yeast morphology and budding patterns are considered a hallmark of this fungus, and previous genetic studies have highlighted the relevance of the cell division cycle 42 (CDC42) expression on such phenotype. Nevertheless, the morphological trends followed by each Paracoccidioides isolate were never evaluated. Similarly, a possible association between genetic factors determining the fungus morphology and the morphological pattern of each isolate was never addressed. To address these issues, a detailed morphogenetic evaluation was carried out in the yeast-form of 11 clinical and environmental Paracoccidioides isolates from the different groups of P. brasiliensis and Paracoccidioides lutzii species. We found that each phylogenetic group does not follow any characteristic morphologic profile, whereas bud area and shape of each isolate reveals to be highly dependent on the mother cell, indicating a high level of conservation of these traits throughout cell progeny. Importantly, we also found strong correlations between PbCDC42 expression (a molecule known to control the morphological behavior of the yeast phase) and both the shape of mother and bud cells and the area of the buds. Altogether, these findings further explore the polymorphic nature of P. brasiliensis, providing information on the trends followed by P. brasiliensis. During the conidia/mycelium-to–yeast transition, a known requirement for the pathogenesis of this fungus, several morphological and phenotypical alterations occur. Among these alterations, the auxotrophy to organic sulfur compounds that is associated to the yeast phase of P. brasiliensis is particularly striking. Although this yeast-phase related nutritional requirement is shared with other dimorphic fungi, the molecular bases underlying it are yet to be uncovered. In this sense, we addressed the role of SconCp, the negative regulator of the inorganic sulfur assimilation pathway, in the fungus dimorphism and virulence. By means of genetic down-regulation of SCONC, we show that P. brasiliensis can overcome its yeast-auxotrophy to organic sulfur compounds, being able to assimilate inorganic sulfur. However, this revealed to drastically reduce the ATP and NADPH cellular levels, leading to increased oxidative cellular stress. This redox imbalance, consequence of the activation of the inorganic sulfur assimilatory pathway, probably led to the decreased virulence of the knock-down isolates, as we show using a mouse model of infection. Our data provides relevant insights on the mechanisms controlling P. brasiliensis dimorphism, revealing SconCp as a novel virulence determinant. P. brasiliensis yeast form is also characterized by its multinucleated nature. Thus, knowing that during the infection fungal cell death is likely to result in the release of large amounts of DNA, one could expect the triggering of innate immune mechanisms of the host via Toll-Like Receptor 9 (TLR9). This molecule is the member of the TLR family known to recognize unmethylated CpG sequences in DNA molecules. Nevertheless, TLR9 role during P. brasiliensis infections was never assessed. We herein demonstrate that activation of this receptor upon recognition of P. brasiliensis yeast cells is an event that seems to be crucial in early-times of infection. Lack of this receptor caused the premature death of the hosts (in a mouse model of infection with P. brasiliensis yeast cells), associated with signs of organ-pathology and high production of pro-inflammatory cytokines. One possible explanation for this profile can be the abnormal neutrophilia observed in TLR9-depleted infected mice. Overall, we show that TLR9 activation is immuno-protective in early stages of P. brasiliensis infections, playing an important role on the development of a controlled cell-mediated response. The work developed throughout this thesis provides new data on the morphological traits followed by the pathogenic fungus P. brasiliensis, and further establishes the relevance of CDC42 on the heterogeneity of cell shape. Moreover, we present new data on the yeast-phase metabolism, further clarifying how dimorphism impacts sulfur metabolism and its relevance for pathogenesis. We also provide relevant data for the elucidation of the mechanisms prompted by the host for the development of an appropriate immune response against P. brasiliensis infections, bringing together the multinucleated nature of this pathogen with the protective activation of the pattern recognition receptor TLR9.

Nas últimas décadas obtiveram-se avanços significativos no estudo de doenças negligenciadas, nomeadamente no que concerne à elucidação da genética do organismo patogénico e de factores de risco do hospedeiro. A paracoccidioidomicose, uma micose causada por espécies de Paracoccidioides, é um desses casos, estimando-se afectar cerca de 10 milhões de indivíduos em países da América Latina. Diversos estudos, nomeadamente aqueles focados na genómica e transcriptómica de isolados de Paracoccidioides brasiliensis, têm levantado questões importantes, particularmente no que respeita ao efeito que a sua natureza multinucleada e variabilidade morfológica possa ter na activação de mecanismos de defesa do hospedeiro, um aspecto nunca abordado até à data. Além destes aspectos, a ausência de ferramentas moleculares é um factor que tem vindo a dificultar tanto a identificação de factores genéticos envolvidos na virulência e natureza polimórfica da fase leveduriforme do fungo, bem como a elucidação dos mecanismos subjacentes ao seu comportamento dimórfico. Uma particularidade da fase leveduriforme destas espécies é a sua heterogeneidade morfológica, assim como os seus padrões de gemulação. Estudos anteriores salientam a importância do gene CDC42 (cell division cycle 42) na definição destas características, no entanto, estas nunca foram determinadas individualmente para cada isolado de Paracoccidioides. Outro aspecto nunca abordado é a identificação de possíveis associações entre factores genéticos que determinem a morfologia do fungo e o padrão morfológico de cada isolado. De forma a elucidar estes aspectos, realizou-se uma detalhada análise morfogenética da fase leveduriforme de 11 isolados clínicos e ambientais de Paracoccidioides pertencentes a espécies de P. brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. Os nossos resultados demonstram a ausência de um perfil morfológico característico para cada uma das linhagens destas espécies. No entanto, a área e forma das gémulas de cada isolado revelou-se altamente dependente da célula-mãe, sugerindo um elevado nível de conservação destas características ao longo das várias gerações. De referir também as fortes correlações encontradas entre a expressão do gene PbCDC42, uma peça importante no controlo do comportamento morfológico da fase leveduriforme, e a forma das células-mãe e gémulas, assim como com a área das gémulas. Estes dados permitem ampliar o conhecimento actual referente à natureza polimórfica de P. brasiliensis, nomeadamente no que respeita à clarificação das suas características morfológicas. Em P. brasiliensis, diversas alterações morfológicas e fenotípicas ocorrem durante o processo de transição da fase de conídeo/micélio para a fase leveduriforme, um processo fundamental inerente à patogenicidade do fungo. Para além destas alterações, a auxotrofia da fase leveduriforme para compostos de enxofre orgânico é também uma característica marcante. Embora este requisito nutricional seja comum a outros fungos dimórficos, as suas bases moleculares nunca foram clarificadas. Neste contexto, procedeu-se à avaliação do papel da proteína SconC, um regulador negativo da via de assimilação do enxofre inorgânico, no dimorfismo e virulência do fungo. Através da redução de expressão do gene SCONC por manipulação genética demonstrou-se que, nestas circunstâncias, a fase leveduriforme das células de P. brasiliensis consegue ultrapassar a sua auxotrofia a compostos de enxofre orgânico, utilizando fontes de enxofre inorgânico. No entanto, esta alteração metabólica levou a uma redução drástica dos níveis celulares de ATP e NADPH, provocando um aumento significativo do stress oxidativo. Este facto pode explicar a diminuição de virulência observada nas estirpes de P. brasiliensis reduzidas na expressão do gene SCONC, como verificado experimentalmente em ensaios com ratinhos. Os resultados aqui apresentados fornecem informações relevantes relativas ao controlo dos mecanismos subjacentes ao processo dimórfico de P. brasiliensis, evidenciando SconCp como uma molécula determinante no processo de virulência. A forma leveduriforme de P. brasiliensis é também caracterizada pela sua natureza multinucleada. Durante o processo de infecção, a morte celular do fungo pode resultar na libertação de elevadas quantidades de DNA, levando eventualmente à activação de mecanismo de imunidade inata via receptores Toll-like 9 (TLR9) por parte do hospedeiro. O TLR9 é a molécula da família dos receptores Toll-like responsável pelo reconhecimento de sequências CpG não-metiladas em moléculas de DNA. No entanto, o papel deste receptor no contexto de infecções por P. brasiliensis nunca foi explorado. Neste trabalho demostrou-se que a activação deste receptor é um processo que parece ser crucial durante as fases iniciais de infecção com P. brasiliensis. Utilizando como modelo ratinhos deletados em TLR9, verificou-se uma morte prematura do hospedeiro aquando da sua infecção com células de P. brasiliensis, associada a sinais de patologia em vários órgãos e elevada produção de citocinas pró-inflamatórias. Este perfil pode estar associado ao elevado recrutamento de neutrófilos para o local de infecção. Em suma, demonstrou-se que a activação de TLR9 é imuno-protectora em fases iniciais de infecções por P. brasiliensis, tendo um papel preponderante no controlo do desenvolvimento de uma resposta imune mediada por células. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese acrescenta novos conhecimentos relativamente à morfologia de P. brasiliensis, relevando-se a importância dos níveis de expressão do gene CDC42 no perfil morfológico da fase leveduriforme do fungo. São também apresentados novos dados sobre o metabolismo da fase leveduriforme de P. brasiliensis, permitindo esclarecer o impacto do dimorfismo celular no metabolismo de enxofre e sua relevância na patogenicidade do fungo. São também apresentados dados essenciais que permitem novos conhecimentos sobre os mecanismos desenvolvidos pelo hospedeiro numa resposta imune apropriada a infecções por P. brasiliensis, associando-se a natureza multinucleada do fungo com a activação de mecanismos de defesa via TLR9.