Optimization of Candida albicans biofilms inactivation by benzophenoxazine compounds for photodynamic therapy

Abstract

The incidence of fungal infections has increased in the last decades, being Candida albicans the most common etiologic agent of fungal-related biofilm infections. In the last years, Candida strains have shown high levels of drug resistance, so the interest in new antifungal therapeutic options has increased. The antimicrobial photodynamic therapy (APDT) has been shown to be an emerging and promising approach to treat localized infections. The present dissertation aimed to optimize the antifungal photodynamic efficacy of two new benzophenoxazine-type fluorescent dyes against C. albicans biofilms by APDT, as well as to understand the different APDT outcomes achieved. The antifungal susceptibility of C. albicans planktonic cells to dyes N-[5-(3- hydroxypropylamino)-10-methyl-9H-benzo[a]phenoxazin-9-ylidene]ethanaminium chloride (FSc) and N-(5-(11-hydroxyundecylamino)-10-methyl-9H-benzo[a]phenoxazin-9-ylidene)ethanaminium chloride (FSd) with concentrations in the range of 0-100 μM during 48 h was firstly determined. The potential photodynamic activity of dyes against C. albicans biofilms was then evaluated and optimized by incubation of biofilms with dyes in the range of 100-300 μM for 3 or 18 h followed by illumination at fluences of 12 or 36 J cm-2 through the use of a xenon arc lamp (600 ± 2 nm). In order to understand the APDT outcomes achieved, dye uptake by the biofilm matrix and cells during dark incubation was also evaluated by spectrofluorimetric analysis (ex=590 nm; em=645 nm) and fluorescence microscopy. On antifungal susceptibility assays, FSc dye showed no growth inhibition of C. albicans cells, while FSd produced a very poor growth inhibition when used at 50 and 100 μM. Regarding to APDT outcomes, only FSc dye showed to have photosensitizing activity against C. albicans biofilms. Using FSc at 300 μM for 18 h followed by illumination with 36 J cm-2 of fluence, a total photoinactivation of C. albicans biofilm cells was achieved. The notorious uptake of FSc over FSd dye by biofilms may explain its higher photodynamic effectiveness. In summary, data suggests that FSc-mediated APDT might be successfully used to treat C. albicans infections.

A incidência de infeções fúngicas tem aumentado nas últimas décadas, sendo a espécie C. albicans o agente etiológico mais comum nas infeções causadas por biofilmes. Nos últimos anos, as estirpes do género Candida têm demonstrado elevados níveis de resistência aos agentes antifúngicos convencionais, impulsionando o interesse por novas terapias antifúngicas. A fototerapia dinâmica antimicrobiana é uma nova abordagem terapêutica que se tem demonstrado bastante promissora no tratamento de infeções localizadas. A presente dissertação teve como objetivo otimizar a inativação de biofilmes de C. albicans pela ação fotodinâmica antifúngica de dois novos corantes fluorescentes do tipo benzofenoxazina, assim como analisar as diferentes eficácias fotodinâmicas encontradas. Inicialmente determinou-se a suscetibilidade antifúngica aos corantes cloreto de N-(5-((3- hidroxipropil)amino)-10-metil-9H-benzo[a]fenoxazina-9-ilidene)etanamínio (FSc) e cloreto de N-(5- ((11-hidroxiundecil)amino)-10-metil-9H-benzo[a]fenoxazina-9-ilidene)etanamínio (FSd) - utilizando concentrações de 0-100 μM durante 48 h em células planctónicas de C. albicans. A potencial atividade fotodinâmica dos corantes em biofilmes de C. albicans foi posteriormente avaliada e otimizada incubando os biofilmes de C. albicans com os corantes com concentrações de 100- 300 μM durante 3 ou 18 h, seguido de irradiação com uma lâmpada de arco de xénon (600 ± 2 nm) com fluência de 12 ou 36 J cm-2. Com o intuito de entender as diferentes eficácias fotodinâmicas observadas, foi também avaliada a absorção dos corantes por espetrofluorimetria (ex=590 nm; em=645 nm) e microscopia de fluorescência. Os ensaios de suscetibilidade antifúngica revelaram que o corante FSc não apresenta efeito de inibição de crescimento, enquanto o corante FSd produz um pequeno efeito de inibição do crescimento quanto utlizado a 50 ou 100 μM. Relativamente à ação fotodinâmica antimicrobiana apenas o corante FSc demonstrou ter atividade fotossensibilizante nos biofilmes de C. albicans. Da incubação dos biofilmes com corante FSc a 300 μM durante 18 h, seguido de irradiação com 36 J cm-2 de fluência, obteve-se uma total inativação celular. A notória absorção do corante FSc em relação ao FSd pelos biofilmes poderá explicar a sua maior eficácia fotodinâmica. Em suma, os resultados indicam que o corante FSc poderá ser um potencial agente fotossensibilizante para a fototerapia dinâmica antifúngica de infeções provocadas por C. albicans.