Study of the efficacy of combination therapy based on bacteriophages for the control of infectious biofilms

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is regarded as a “phenomenon of bacterial resistance”. This gram negative bacterium is responsible for a high percentage of mortality in the hospitals all over the world and its prevalence can be a consequence of important reasons, such as: intrinsic resistance determined by virulence factors; acquired resistance mechanisms that lead to a low susceptibility to antimicrobial agents; and the ability of P. aeruginosa to grow on any natural and artificial surfaces leading to the development of biofilms. The emergence of new strategies to control P. aeruginosa biofilms is becoming more evident due to their resistance to traditional treatments, and (bacterio)phages have been recognized as an attractive alternative for this problem. Nevertheless, despite the potential of phages as antimicrobial agents, it is well known that bacteria can quickly adapt and create new survival strategies and the emergence of phage-resistant phenotypes is inevitable. Thus, the combination of phage and antibiotic therapies could have potentially more benefits than just using phages and antibiotics alone. This work describes the combined effect of phages and antibiotics against planktonic cultures and biofilms of P. aeruginosa. The antimicrobial susceptibility of three reference strains of P. aeruginosa towards antibiotics belonging to four different action groups was initially evaluated and for this purpose, two important parameters were determined: Minimal Inhibitory Concentration (MIC) for planktonic cultures and Minimal Biofilm Eradication Concentration (MBEC) for biofilms. After that, phage infection assays were performed against cultures and biofilms of P. aeruginosa using four different phages from the Bacteriophage Biotechnology Group of the University of Minho. The efficacies of antibiotics and phages or both combined were evaluated in biofilms by viable cell enumeration and in planktonic cultures by measuring the absorbance (OD600nm). In general, all antibiotics tested showed little efficacy against biofilms which were also very tolerant to phage infection. The presence of degradative enzymes, such as beta-lactamase, and the survival of tolerant cells (persister cells) can explain the failure of antibiotics in reducing the cell numbers present in biofilms. In the case of phage infection, the emergence of resistant phenotypes defective in LPS mutants can lead to long-term failure of these agents. In combined treatments, phages used together with ciprofloxacin caused total biofilm eradication. Also, other combinations resulted in interesting results. For example, the combination therapy of both phage phiIBB-PAP21 and amikacin resulted in approximately 3.66 log reduction of viable cells while individually, phage and amikacin only caused a 1.3 and 1.76 log reduction, respectively. The effectiveness of combined phages-antibiotic treatments can be due to a higher burst size, as observed with phage phiIBB-PAP21, when their host cells were exposed to antibiotics. Also, the higher biomass reductions observed when biofilms are exposed to a combined treatment suggest that phages can enhance the antibiotic penetration through matrix disruption, rendering cells freely available to be killed with antibiotics. Overall, the combination of phage and antibiotic enhances biofilm control; however the complex universe behind this synergistic interaction suggests that this is not always a linear process. Further studies should be conducted to complement and disclose this synergistic behaviour observed in the work described herein.

Pseudomonas aeruginosa é considerada um "fenómeno da resistência bacteriana". Esta bactéria gram-negativa é responsável por uma elevada percentagem de mortalidade nos hospitais de todo o mundo e a sua prevalência pode ser consequência de razões importantes como: resistência intrínseca determinada por vários fatores de virulência; mecanismos de resistência adquiridos que conduzem a uma baixa suscetibilidade aos agentes antimicrobianos e a capacidade de crescimento de P. aeruginosa em todas as superfícies naturais e artificiais que favorece ao desenvolvimento de biofilmes. A necessidade de novas estratégias de controlo de biofilmes de P. aeruginosa tem-se tornado mais evidente devido à sua resistência aos tratamentos tradicionais, e os bacteriófagos têm sido reconhecidos como uma alternativa atrativa para este problema. No entanto, apesar do potencial dos fagos como agentes antimicrobianos, sabe-se que as bactérias podem adaptar-se rapidamente e criar novas estratégias de sobrevivência e o aparecimento de fenótipos resistentes aos fagos é inevitável. Assim, a combinação de fagos com as terapias antibióticas pode ter potencialmente mais benefícios em relação á utilização isolada de fagos e antibióticos. Este trabalho descreve o efeito combinado de fagos e antibióticos contra culturas planctónicas e biofilmes de P. aeruginosa. A suscetibilidade antimicrobiana de três estirpes de referência de P. aeruginosa contra antibióticos pertencentes a quatro grupos de ação diferentes foi inicialmente avaliada. Para este fim, dois parâmetros importantes foram determinados: Concentração Mínima Inibitória (CIM) para culturas planctónicas e Concentração Mínima de Erradicação do Biofilme (CMEB) para os biofilmes. Depois desta etapa realizaram-se ensaios de infeção fágica contra as culturas e biofilmes de P. aeruginosa utilizando quatro fagos diferentes do Grupo de Biotecnologia de Bacteriófagos da Universidade do Minho. A eficácia dos antibióticos e fagos ou dos dois agentes combinados foi avaliada nos biofilmes pela enumeração de células viáveis, e nas culturas planctónicas pela medição da absorvência (OD600nm). Em geral, todos os antibióticos testados apresentaram pouca eficácia contra os biofilmes, os quais também foram muito tolerantes à infeção fágica. A presença de enzimas de degradação, tais como a beta-lactamase, e a sobrevivência de células tolerantes (células persister) pode explicar a falha dos antibióticos sobre a redução do número de células presentes nos biofilmes. No caso da infeção fágica, o aparecimento de fenótipos deficientes na produção de LPS pode conduzir ao insucesso destes agentes a longo prazo. Nos tratamentos combinados, os fagos utilizados juntamente com ciprofloxacina causaram a erradicação total do biofilme. Também outras combinações demonstraram resultados interessantes. Por exemplo, a combinação de ambos fago phiIBB-PAP21 e amicacina resultou numa redução de células viáveis de cerca de 3,66 log, enquanto individualmente, o fago e amicacina só provocou uma redução de 1,3log e 1,76log, respetivamente. A eficácia da combinação fago-antibiótico pode ser devido a elevados burst size, tal como observado com o fago phiIBB-PAP21, quando o respetivo hospedeiro foi exposto a antibióticos. Além disso, as maiores reduções da biomassa observadas quando os biofilmes são expostos a um tratamento combinado sugerem que os fagos podem melhorar a penetração de antibióticos através de rutura da matriz, permitindo uma libertação das células para a ação dos antibióticos. Em geral, a combinação de fagos e antibióticos permite melhorar o controlo dos biofilmes; no entanto o universo complexo por trás desta interação de sinergia sugere que esta não é sempre um processo linear. Novos estudos devem ser realizados para complementar e divulgar este comportamento sinergístico observado neste trabalho.