Biotransformação do óleo de rícino em aromas por Yarrowia lipolytica

Abstract

Os compostos aromáticos produzidos por processos biotecnológicos são cada vez mais aceites pelo mercado consumidor, por serem considerados naturais. Além disso, são processos de grande interesse devido aos elevados rendimentos que apresentam relativamente aos processos de extracção a partir de fontes naturais. A γ-decalactona é um composto aromático de interesse industrial, que resulta da β-oxidação peroxisomal do ácido ricinoleico. Este ácido gordo, maior constituinte do óleo de rícino, é o precursor mais vulgarmente utilizado na produção biotecnológica deste aroma. Para que o substrato (óleo de rícino) esteja mais disponível para as células o utilizarem na produção de γ-decalactona, pode utilizar-se óleo de rícino hidrolisado. Esta hidrólise pode ser promovida por acção enzimática, mais especificamente por lipases. O objectivo geral do presente trabalho consiste na avaliação do papel das lipases, comerciais e produzidas pela levedura, na hidrólise do óleo de rícino e consequente impacto na produção de γ-decalactona. Inicialmente foi feita a validação do método experimental utilizado para determinar a actividade lipolítica, tendo-se concluído que o método que utiliza como substrato o p-nitrofenil laurato não era preciso. Assim, nos ensaios posteriores de determinação da actividade lipolítica foi empregue o substrato p-nitrofenil butirato, que forneceu resultados mais precisos. Realizaram-se ensaios de caracterização da actividade de várias enzimas comerciais solúveis e imobilizadas. Os ensaios tiveram como finalidade avaliar a actividade lipolítica das diferentes enzimas e permitiram concluir que a lipase de C. rugosa (5.873 U*mg-1 enzima) apresenta uma actividade bastante superior à das outras enzimas analisadas, Lipozyme TL IM, Lipolase 100 T e Lipase CALB L. Com o intuito de estudar quais as condições que conduzem a um maior grau de hidrólise do óleo de rícino realizaram-se ensaios com as diferentes lipases comerciais estudadas, tendo-se variado as condições de temperatura, pH e concentração de óleo de rícino. A maior percentagem de hidrólise (95.37 %) foi obtida quando se utilizou a enzima Lipozyme TL IM, a pH 8 e 27 ºC, ao fim de 45 horas. Nos ensaios de produção de lipase por diferentes estirpes de Y. lipolytica observou-se que a produção de enzima é favorecida quando o meio de produção de lipase é adicionado ao meio de crescimento celular, sem ocorrer centrifugação das células na transferência entre meios. Foram comparados vários substratos na indução de lipase e verificou-se que, para a estirpe Yarrowia lipolytica W29, foi o ricinoleato de metilo que se revelou o melhor indutor para a produção de lipase, nas condições analisadas. Nos ensaios de biotransformação do óleo de rícino em γ-decalactona verificou-se que a etapa inicial de hidrólise do óleo não se revelou crucial para o aumento da produtividade. A maior produção de γ-decalactona (1600 mg*mL-1) foi obtida usando óleo de rícino não hidrolisado e sem adição de lipase extracelular, sendo que a produtividade foi melhorada pelo aumento da velocidade de agitação.

The aromatic compounds produced by biotechnological processes are increasingly accepted by consumers, because they are considered as natural compounds. In addition, they are of great interest due to the high yields obtained comparatively to chemical processes. γ-Decalactone is an aromatic compound of industrial interest, resulting from the peroxisomal β-oxidation of ricinoleic acid. This fatty acid, the major constituent of castor oil, is the precursor most commonly used in the biotechnological production of this aroma. In order to increase the availability of the substrate (castor oil) to the cells for the production of γ-decalactone, hydrolyzed castor oil can be used. This hydrolysis can be promoted by enzymatic action, more specifically by lipases. The main goal of the present work is to assess the role of lipases, both commercial and produced by the yeast, in the hydrolysis of castor oil and the consequent impact on the production of γ-decalactone. Initially, a validation of the experimental method used to determine the lipolytic activity was developed, and it was concluded that the method using the substrate p-nitrophenyl laurate was not accurate. Thus, in the subsequent experiments to determine the lipolytic activity, the substrate p- nitrophenyl butyrate was used, providing more accurate results. Experiments were performed in order to determine the activity of several commercial enzymes, soluble and immobilized. The aim of those essays was to evaluate the lipolytic activity of the different enzymes. The results allowed to conclude that, from all enzymes analyzed, the lipase of C. rugosa (5.873 U*mg-1 enzyme) presents the highest activity. It was also aim of this work to study the conditions that lead to a greater hydrolysis rate of castor oil. Thus, assays were performed with different commercial lipases previously studied, under different operating conditions, such as temperature, pH and castor oil concentration. The largest percentage of hydrolysis (95.37 %) was achieved when using the enzyme Lipozyme TL IM, at pH 8 and 27 ºC, after 45 hours. In lipase production essays, carried out by different strains of Y. lipolytica, lipase production was improved when the components of the production medium were added to the inoculum culture without harvesting and centrifuging cells in the transfer between both media.Different substrates were tested as lipase inducers and it was observed that, for the strain Yarrowia lipolytica W29, methyl ricinoleate revealed to be the best lipase inducer, for the conditions tested. The biotransformation of castor oil into γ-decalactone was not improved by the initial step of oil hydrolysis. The highest production of γ-decalactone (1600 mg*mL-1) was obtained using non-hydrolyzed castor oil and without adding extracellular lipase.Moreover, the productivity was improved by increased agitation rates.