Affinity partitioning and purification of plasmid DNA in aqueous two-phase systems

Abstract

Plasmid DNA (pDNA) vectors are being developed as preventive or therapeutic DNA medicines for the treatment of parasitic, bacterial and viral diseases and also for other indications, such as the treatment of devastating inherited diseases. This has been reflected in a demand for efficient and cost-effective large-scale processes for the production of pharmaceutical-grade pDNA. The utilisation of aqueous two-phase systems (ATPS) for the extraction of pDNA has several advantages over the conventional chromatographic processes; namely, easier scaling-up, operation simplicity, higher capacity, and the possibility to combine purification, concentration and clarification into one unit operation. However, the main drawback of ATPS is the low selectivity for the target pDNA in complex Escherichia coli cell lysates. In this thesis two proteinbased affinity systems were investigated in order to enhance selectivity of the ATPS by exploring sequence-specific recognition of target pDNA: 1) GST-ZnF/pTS: a fusion protein, comprised of Glutathione-S-Transferase (GST) and a zinc finger transcription factor (ZnF) that binds to 5´- GGGGCGGCT-3´ sequence within pTS plasmid. 2) LacI-His6-GFP/pUC19: a lac repressor protein (LacI) fused to a His6-tag and to a Green Fluorescence Protein (GFP) that displays affinity for two lac operator sequences (lacO1/lacO3) within pUC19 plasmid. Initially, polyethylene glycol (PEG) - dextran (DEX) systems were selected for the favourable partitioning of the pDNA impurities to one of the phases, i.e. dextran. In this way the affinity ligand would steer the pDNA to a phase with less impurities, so increasing its purity and the selectivity of these systems. The PEG 600 – DEX 40 system was selected with all major pDNA impurities accumulated predominantly in the bottom DEX phase (RNA >99 % and protein >80 %) with total pDNA recoveries >80 %. In order to efficiently steer the affinity ligand into the top phase, the GST-ZnF fusion protein was covalently bound to PEG polymer (PEGylation). Initially, four different PEGylation reagents were optimized for conjugation to the free GST. Thiol selective PEGylation reactions were completed after 1h under reducing conditions. By contrast, amine selective reagents required much longer reaction times (24h) or high PEG equivalents, in order to yield more than 80% conjugation. Optimized reactions on free GST were then applied to GST-ZnF fusion protein resulting in similar PEGylation yields. The PEG-GST-ZnF ligand was then used for the complete isolation of pre-purified pTS plasmid from bottom phase to the top phase in PEG 600 – DEX 40 systems. The PEGylated ligand accumulated 97.5 % in the top phase, while 96.5 % of the native GSTZnF protein and 99.9 % pDNA accumulated on the bottom. Although the proofof- concept for a pDNA affinity extraction process was demonstrated, no further assays were carried out using bacterial cell lysates due to the tight protein–DNA binding which make the elution of the pDNA impractical. An alternative approach to attach PEG to the affinity ligand was tested with an immobilized metal–ion affinity PEG (PEG-IDA-Cu2+) which binds to the his-tag accessible on the surface of LacI-His6-GFP protein. The affinity extraction of pUC19 plasmid from a bacterial cell lysate in PEG 600 – DEX 40 ATPS containing 0.273 nmol of LacI fusion protein and 0.14 % (w/w) functionalised PEG, resulted in more than 72 % of the plasmid DNA partition to the top phase, without RNA or genomic DNA impurities. Although pDNA elution from LacI binding complex proved to be difficult, the method described removed more than 75 % of the protein yielding ~27 % of pCU19 pDNA. This represents about 7.4 μg of pDNA extracted per mL of desalted lysate which is about 9 fold improvement to what was previously obtained using LacI-His6-GFP immobilized into a chromatographic column. To conclude, it is envisaged in this thesis that the knowledge obtained using pDNA affinity ligands would contribute for the development of a highly selective plasmid DNA manufacturing process fulfilling the stringent specifications and demands for gene therapy or DNA vaccines applications.

Vectores de DNA plasmídeo (pDNA) estão a ser desenvolvidos para a prevenção e tratamento de doenças do foro viral, bacteriano e parasitário, bem como, para o tratamento de doenças crónicas hereditárias. Nesse sentido, existe a necessidade crescente de processos eficientes e económicos de produção industrial de pDNA com qualidade farmacêutica. A utilização de sistemas de duas-fases aquosas (SDFA) para a purificação de pDNA tem várias vantagens comparativamente aos processos cromatográficos convencionais, nomeadamente a facilidade de aumento de escala, maior capacidade e a possibilidade de combinar numa única operação os processos de purificação, concentração e clarificação. No entanto, a maior desvantagem dos SDFA deve-se à sua baixa selectividade para os vectores pDNA em lisados celulares de Escherichia coli. Nesta tese, foram investigados dois sistemas de afinidade com o objectivo de aumentar a selectividade dos SDFA utilizando ligandos proteicos com especificidade de ligação ao pDNA: 1) GST-ZnF/pTS: proteína fusão, composta pela proteína Glutationa-STransferase (GST) e um factor de transcrição dedo do zinco (ZnF), que se liga à sequência 5´-GGGGCGGCT-3´ do plasmídeo designado por pTS. 2) LacI-His6-GFP/pUC19: proteína fusão, constituída pela proteína repressora do operão lac (LacI) fundida com 6 resíduos de aminoácidos de histidina e com a proteína verde fluorescente (GFP), que se liga a duas sequências lac operão (lacO1/lacO3) do plasmídeo pUC19. Inicialmente, SDFA com polietilenoglicol (PEG) e dextrano (DEX) foram seleccionados de acordo com a acumulação preferencial na fase de DEX (ou fase inferior) dos contaminantes principais do pDNA presentes nos lisados. Deste modo, os ligandos de afinidade permitem extrair o pDNA para a fase com menos contaminantes - fase de PEG - aumentando assim o grau de purificação e selectividade dos SDFA. O sistema PEG 600 – DEX 40 foi seleccionado para o efeito, obtendo-se a acumulação do RNA (>99 %) e das proteínas (>80 %) na fase inferior e com recuperação superior a 80 % do pDNA. Para facilitar a partição do ligando para a fase superior, a proteína GST-ZnF foi ligada covalentemente ao polímero PEG (PEGuilação). Inicialmente, 4 reacções de conjugação foram optimizadas usando a proteína GST livre. A PEGuilação dos grupos tiol foi total ao fim de 1 h em condições redutoras. Conjugações superiores a 80 % com os grupos amina foram obtidas ao fim de 24 h ou usando uma maior razão reagente/ligando. As reacções optimizadas foram de seguida aplicadas à proteína fusão GST-ZnF, resultando em rendimentos semelhantes. O ligando PEG-GST-ZnF foi posteriormente usado para transferir totalmente o plasmídeo pTS da fase inferior para a fase superior em sistemas PEG 600 – DEX 40. O ligando PEGuilado acumulou-se 97,5 % na fase superior, enquanto que a proteína GST-ZnF nativa e o plasmídeo pTS, acumularam-se 96,5 % e 99,9 % na fase de DEX, respectivamente. Embora o “proof-ofconcept” para um processo de extracção de pDNA por afinidade tenha sido estabelecido, o processo não foi testado com lisados bacterianos dado que a ligação GST-ZnF/pDNA é extremamente forte e a sua eluição impraticável. Foi ainda desenvolvido um processo alternativo para ligar PEG ao ligando, usando PEG funcionalizado com iões metálicos (PEG-IDA-Cu2+) com afinidade para as histidinas à superfície da proteína LacI-His6-GFP. A extracção do plasmídeo pUC19 de lisados celulares em SDFA foi realizada com a presença de 0,273 nmol do ligando LacI-His6-GFP e 0,14 % (w/w) de PEG funcionalizado. Cerca de 72 % do pUC19 acumulou-se na fase superior, sem a co-purificação de RNA ou DNA genómico. Embora a eluição do pDNA se tenha provado difícil, a metodologia desenvolvida permitiu remover 75 % da proteína total e obter um rendimento final de 27 % de pUC19 (7,4 μg pUC19 por mL lisado). Estes resultados correspondem a uma capacidade 9 vezes superior ao método cromatográfico descrito na literatura com o mesmo ligando. Em suma, este trabalho resultou no aumento de conhecimento na utilização de ligandos de afinidade em SDFA que poderá contribuir para o futuro desenvolvimento de processos industriais com alta especificidade para o pDNA, satisfazendo as especificações e procura de pDNA para terapia genética e vacinas de DNA.