The role of codY and pdhA in S. epidermidis biofilms, VBNC cells formation and virulence

Abstract

Staphylococcus epidermidis, uma bácteria comensal que habita na pele e mucosas humanas saudáveis, é uma das principais causas de infeções associadas aos cuidados de saúde. A capacidade de S. epidermidis formar biofilmes em dispositivos médicos é o seu principal fator de virulência, o que contribui para a redução da eficiência dos antibióticos, evasão à resposta do sistema imunitário do hospedeiro e para a recorrência das infeções. Os biofilmes bacterianos apresentam diferentes subpopulações tal como as células viáveis mas não cultiváveis (VNC), que são conhecidas por surgirem em condições ambientais adversas. CodY, um regulador da transcrição, foi previamente reconhecido como um repressor da expressão de centenas de genes em diferentes espécies bacterianas sob condições desfavoráveis. Ainda, através de uma análise de imunoproteómica, o CodY foi identificado como um potencial fator na indução de células VNC em biofilmes formados por S. epidermidis. Considerando estes factos, construímos e caracterizamos uma estirpe mutante, sem o gene codY, para determinar o seu papel na indução do estado VNC e noutros fatores de virulência. O primeiro ensaio experimental foi focado na validação de um modelo de indução da formação de células VNC in vitro previamente desenvolvido. É importante salientar que também demonstramos a formação de células VNC em populações planctónicas, seguindo o mesmo mecanismo de indução utilizado em biofilmes. Em relação à caracterização da estirpe mutante, esta apresentou uma taxa de crescimento e de capacidade de formação de biofilme reduzidas em comparação com a estirpe selvagem. Sob condições indutoras do estado VNC, foi observado um maior número de células cultiváveis em biofilmes formados pela estirpe mutante. Adicionalmente, avaliamos o impacto da deleção do gene codY na capacidade da bactéria sobreviver no sangue e plasma humano, e na sua susceptibilidade a antibióticos. Os nossos dados revelaram que a deleção do gene codY tornou a bactéria mais suscetível à rifampicina, mas não foram encontradas diferenças significativas na sobrevivência bacteriana no sangue ou no plasma humano. Contudo, em estudos funcionais com macrófagos humanos, a estirpe mutante mostrou estimular uma resposta pró-inflamatória mais exacerbada em relação à estirpe selvagem. No geral, os nossos dados sugerem um papel importante do gene codY na virulência de S. epidermidis.

Staphylococcus epidermidis, a commensal bacteria that inhabits healthy human skin and mucous membranes, is the cause of healthcare-associated infections. The ability of S. epidermidis to form biofilm on medical devices is the foremost virulence factor, which contributes to the reduced antibiotics efficiency, evasion from the host immune system response and the recurrence of biofilm-related infections. The bacterial biofilm harbours different subpopulations, such as viable but non-culturable (VBNC) cells, which are known to arise in adverse environmental conditions. CodY, a transcription regulator, was previously found to repress the expression of hundreds of genes in different bacterial species under unfavourable conditions. Additionally, in a previous immunoproteomic analysis, CodY was identified as a potential key player in the induction of VBNC cells in S. epidermidis biofilms. Considering these facts, we constructed and characterized a mutant strain lacking the codY gene, to determine its role in VBNC state induction and other virulence factors. The first experimental assay was focused on the validation of a previous in vitro model used to induce the formation of VBNC cells. Importantly, we also demonstrated the possibility to modulate the formation of VBNC cells in planktonic populations, following the same VBNC induction mechanism used in biofilms. Regarding the characterization of the mutant strain, we found a reduced growth rate and biofilm formation ability in comparison to the wild-type strain. Remarkably, under VBNCinducing conditions, a higher number of culturable cells was observed in biofilms formed by the codYmutant strain. Additionally, we also evaluated the impact of the deletion of codY gene on the bacteria’s ability to survive in human blood and plasma, as well as their susceptibility to antibiotics. Our data revealed that the lack of codY rendered the bacteria more susceptible to rifampicin, but no significant differences were found in the bacteria’s survival in both human blood or plasma. After challenging human macrophages with the S. epidermidis strains, a higher pro-inflammatory response was found by the codYmutant strain in comparison to the wild-type strain. Overall, our data suggest an important role of codY in S. epidermidis virulence.