Production of cellulose-binding domains by proteolysis: studies on the adsorption and modification of cellulose fibres

Abstract

Most cellulose degrading enzymes are composed of modular structures. In the case of fungi, cellulases are formed by a catalytic domain (CD) and by a cellulose-binding domain (CBD), interconnected through a highly glycosylated protein linker. These enzymes are used for paper production, either to allow a more efficient refinement or to improve the paper sheet production. This work aimed at implementing a procedure to produce significant amounts of purified CDBs. The purified CBDs coating of the fibers surface was assessed by a method based on fluorescence microscopy. Finally, the application of CBDs in paper production was evaluated. The CBDs production was achieved by proteolysis, with papain, of the commercial preparation Celluclast® (cellulases from Trichoderma reesei). Afterwards, the CBDs were separated by ultrafiltration and further purified by ion exchange chromatography. The obtained CBDs is part of cellobiohydrolase I, as demonstrated by N-terminal peptide sequencing and MALDI-TOF. The isolated proteins kept the highly glycosylated peptide linker, as verified by sugar analysis, that demonstrated the existence of 30% (w/w) of carbohydrates, most of which mannose (85%). It was shown that these CBDs, as expected, have a high cellulose affinity, desorbing very slowly. Using CBDs conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC), it was verified that the adsorption is not uniform, being higher on the fibre extremities and defects, due either to a higher specific surface area (amorphous regions) or to a higher affinity of CBDs to these regions. To quantify the CBDs coating of the fibres’ surface, a MATLAB program was developed. This program allows for the correlation between the fluorescence signal intensity produced by the adsorbed CBF-FITC, and its surface concentration. The FITC photobleaching was verified to be only significant for CBD-FITC in solution, being negligible for the protein adsorbed on cellulose. The adsorption of CBDs to cellulose films (made from cellulose acetate), in saturation concentrations, resulted in the equivalent to 1.6 to 2 layer of protein. In the case of cellulose fibres (Whatman CF11), this value increased to the equivalent of roughly 4 layers. These high values are due to the protein penetration into the fibers, as was demonstrated by confocal microscopy and immunolabelling with colloidal gold and transmision electron microscopy, but also to the increased surface irregularities of Whatman CF11 that would increase the surface area. The CBD adsorption onto primary and secondary fibres implied a reduction of the Schopper-Riegler index (increase in water flow between the fibres) and an increase of both the water retention value (WRV) and air permeability of the handsheets. The strength properties did not suffer a significant variation with adsorbed CBDs, except for the non-refined virgin fibres. In this case, a slight improvement was observed, probably due to the lower surface area. The effect of CBDs on the surface properties was analysed by measuring the ZETA-potencial and contact angles. The adsorption of CBDs chemically conjugated to lysozyme (protein with a positive charge) did not significantly change the papersheet properties. The ZETA-potential was only significantly altered in the case of low surface area fibres (non-refined virgin fibres), as noticed by the reduction of the fibres negative charge. As expected, the variation was more significant with lysozyme conjugated CBD. This higher variation was also confirmed by contact angles measurement. The presence of conjugates made the cellulose film hydrophobic, due to the reduction of the negative polar component of the fibres.

As enzimas que degradam a celulose são maioritariamente constituídas por estruturas modulares. No caso dos fungos, as celulases são constituídas por um domínio catalítico (CD) e um domínio de ligação à celulose (CBD), interligados por uma cadeia proteica altamente glicosilada. As enzimas têm sido amplamente utilizadas na produção de papel, para permitir uma mais eficiente refinação, e melhorar a formação das folhas de papel. Neste trabalho pretendeu-se inicialmente implementar um processo laboratorial de produção de CBDs, em larga escala (grama). Para quantificar a taxa de cobertura dos CBDs sobre a superfície das fibras de celulose, foi desenvolvido um método baseado em microscopia de fluorescência. Posteriormente, avaliou-se o potencial de aplicação dos CBDs na produção de papel. A produção de CBDs foi realizada por hidrólise, usando proteases (papaina), do preparado comercial Celluclast® (celulases do fungo Trichoderma reesei). Posteriormente, os CBDs foram separados por ultrafiltração e posteriormente purificados numa coluna de troca iónica. Os CBDs isolados pertencem à enzima celobiohidrolase I, como foi demonstrado por sequenciação peptídica N-terminal e MALDI-TOF. A proteína purificada inclui a região de ligação altamente glicosilada, como foi verificado pela análise dos açúcares totais, que demonstrou a existência de 30% (m/m) de carbohidratos nas proteínas, em particular de manose (85%). Verificou-se que estes CBDs possuem, como esperado, uma elevada afinidade por celulose. A adsorção a fibras de celulose pura (Whatman CF11) não é irreversível, sendo a desorção muito lenta. Recorrendo à conjugação dos CBDs com isotiocianato de fluoresceina (FITC) verificou-se que a adsorção nas fibras não é uniforme, sendo superior nas extremidades e irregularidades das fibras, devido a um aumento da área superficial disponível para os CBDs (regiões amorfas) ou a uma maior afinidade para estes locais. Para quantificar a taxa de cobertura das fibras pelos CBDs, foi desenvolvido um método baseado em microscopia de fluorescência. Este método passou pelo desenvolvimento de um programa em MATLAB para calibrar o sinal produzido pelos CBDs, permitindo efectuar uma correspondência entre o sinal produzido por fibras com CBD-FITC e a densidade de proteína na superfície das fibras. No desenvolvimento do método tomou-se em consideração a fotoinstabilidade (photobleaching) do FITC, tendo-se verificado que este apenas é significativo para CBD-FITC em solução, mas negligenciável quando adsorvido em celulose. Os CBDs adsorvidos em filmes de celulose (preparados a partir de acetato de celulose), em concentrações saturantes, corresponderam a um revestimento equivalente a 1.6 a 2 camadas de proteína. No caso das fibras de celulose, estes valores aumentaram para o equivalente a cerca de 4 camadas, no caso da Whatman CF11. Estes valores elevados resultam da penetração das proteínas no interior das fibras, como pôde ser demonstrado tanto por microscopia confocal como por microscopia electrónica de transmissão (por imunomarcação com ouro coloidal). A irregularidade da superfície das fibras poderá também aumentar a taxa de cobertura dos CBDs. A adsorção de CBD a fibras de papel, primárias e secundárias, implica uma diminuição do índice de Shopper-Riegler (aumento do escoamento de água das fibras), assim como um aumento do índice de retenção de água (WRV) e da permeabilidade à passagem de ar nas folhas de papel produzidas no laboratório. As propriedades físicas das folhas não sofreram alterações significativas com a adsorção dos CBDs, excepto no caso das fibras virgens não refinadas. Neste caso, os parâmetros mecânicos aumentaram ligeiramente, devido muito provavelmente à menor área superficial destas fibras e logo a uma maior influência dos CBDs adsorvidos. A adsorção de CBDs conjugados com lisozima (proteína com carga positiva) não modificou significativamente as propriedades das folhas. O efeito dos CBDs nas propriedades de superfície das fibras foi analisado através da medição do potencial ZETA e dos ângulos de contacto. O potencial ZETA só variou significativamente no caso das fibras com menor área superficial (fibras virgens não refinadas), traduzindo-se numa diminuição da carga negativa com a adsorção dos CBDs. Esta variação foi também observada com partículas de celulose pura, nos casos em que se usou uma elevada carga proteica. Como esperado, a variação foi mais significativa quando foram utilizados os CBDs conjugados com lisozima. Esta maior variação também foi observada nos ângulos de contacto, onde a presença dos conjugados tornou o filme de celulose hidrofóbico, devido à diminuição do carácter polar negativo das fibras.