Immobilization of β-galactosidase onto different water insoluble matrices

Abstract

Esta tese de Doutoramento é o resultado de um projecto de colaboração entre a Universidade Federal de Pernambuco, Brasil e a Universidade do Minho, Portugal, financiado pelo Programa Alßan de bolsas de estudo de alto nível destinado à América Latina.

Lactases ou β-galactosidases (E.C. 3.2.1.23) são enzimas com um elevado interesse industrial quer na conversão da lactose em galactose e glicose quer na síntese de oligossacarídeos. O seu uso tem sido recomendado para hidrolisar a lactose no leite consumido por aqueles indivíduos com intolerância à lactose, na manufactura de sorvete e na produção de galactooliossacarídeos (GOS), compostos que se inserem nos denominados alimentos funcionais (pré-bióticos).

A imobilização desta biomolécula em suportes de baixo custo, mediante procedimentos de fácil execução, pode potenciar a eficiência catalítica do derivado enzimático por causa da melhor estabilidade ao pH e temperatura, proporcionando deste modo, menores custos operacionais e aumentando suas aplicações biotecnológicas em indústrias de alimentos.

O principal objectivo do trabalho desenvolvido foi avaliar a utilização de β-galactosidase imobilizada em diferentes matrizes insolúveis em água tanto na hidrólise da lactose como na síntese de GOS.

No decorrer do trabalho, foram usados quatro suportes magnéticos: (1) polisiloxano-Álcool Polivinílico magnético – mPOS-PVA; (2) magnetita revestida com polianilina – MAG-PANI; (3) polisiloxano revestido com polianilina – POS-PANI e (4) Dacron magnetizado. β-Galactosidase de duas origens diferentes (Kluyveromyces lactis e Aspergillus oryzae) foram usadas.

Todas as matrizes investigadas foram adequadas para a imobilização de β-galactosidase e para a produção de GOS usando lactose como substrato. A capacidade de formação de GOS pela enzima não foi afectada pela imobilização nos diferentes suportes magnéticos, não se tendo observado diferenças na cinética reaccional de síntese entre a enzima livre e a enzima imobilizada nos diferentes suportes. A caracterização físico-quimica dos suportes contendo a enzima imobilizada permitiu confirmar a ausência de limitações difusionais à transferência de massa. Verificou-se também que a produção de GOS, a diferentes temperaturas 30 – 60ºC, foi praticamente inalterada, tanto para a enzima livre quanto para a imobilizada.

Comparando a eficiência de imobilização dos diferentes suportes, verificou-se que a maior retenção de actividade enzimática de hidrólise e de síntese foi obtida com a enzima imobilizada em Dacron magnetizado.

Foi também desenvolvido um modelo matemático que descreve adequadamente as reacções de hidrólise da lactose e síntese de GOS e efectuada a caracterização química, física e estrutural dos suportes MAG-PANI e POS-PANI.

This PhD thesis is the result of a collaboration project between the Universidade Federal de Pernambuco, Brazil, and the Universidade do Minho, Portugal, financed by the Programme Alßan, a high level scholarship programme specifically addressed to Latin America.

Lactases or β-galactosidases (E.C. 3.2.1.23) are enzymes with an increasing industrial importance for lactose hydrolysis and for oligosaccharides synthesis. Its use has been recommended for the hydrolysis of lactose in milk consumed by lactose intolerant individuals, for ice-cream manufacture and in the production of galactooligosaccharides (GOS), compounds known as functional foods (prebiotics).

The immobilization of β-galactosidase onto low-cost matrices by ease procedures can enhance the catalysis efficiency of the enzymatic derivatives because of the greater stability to pH and temperature, providing thus lower operational costs and increasing their applications in food industry biotechnology.

The main objectives of the developed work were to evaluate the immobilization of β-galactosidase onto different water insoluble matrices both for lactose hydrolysis and GOS synthesis.

Four magnetic matrices were used for enzyme immobilization: (1) polyvinyl alcohol polysiloxane-magnetic - mPOS-PVA; (2) magnetite coated with polyaniline - MAG-PANI; (3) polysiloxane coated with polyaniline - POS-PANI and (4) ferromagnetic Dacron. β-galactosidase from two different origins (Kluyveromyces lactis and Aspergillus oryzae) were used.

All the investigated matrices were suitable for the β-galactosidase immobilization and the GOS production as well, using lactose as substrate. The ability of GOS formation by the enzyme was not affected by the immobilization on the different magnetic matrices and no differences on the kinetics of GOS synthesis were observed between immobilized and free enzymes. The physic-chemical characterization of the supports with the immobilized enzymes allowed the conclusion that diffusional mass transfer limitations were not a concern. It was observed that GOS production in the temperature range of 30 - 60 º C was unchanged for both free and for immobilized enzyme.

In what concerns β-galactosidase immobilization efficiency of the different supports, it was conclude that magnetized Dacron allowed for the highest activity retention both for hydrolysis and synthesis.

Furthermore, a mathematical model describing lactose hydrolysis and GOS synthesis was developed and a detailed chemical, physical and structural characterization of the MAG-PANI and POS-PANI supports was done.