Candida albicans cell wall surface chitinase 3: production, purification, and characterization

Abstract

Candida albicans é uma das principais causas de infeções fúngicas a nível mundial e é a terceira causa mais comum de infeções nosocomiais da corrente sanguínea. É considerada um agente patogénico oportunista, que consegue causar infeções superficiais e crónicas, e em pacientes com imunidade comprometida pode levar a infeções graves com taxas de mortalidade elevadas. Num estudo prévio relativo a infeções por parte deste organismo, foi relatado que uma quitinase da superfície da parede celular não caracterizada, quitinase 3 (Cht3p), de C. albicans, demonstrou capacidade de induzir em ratos uma resposta imunológica contra estas infeções. O presente estudo visou investigar aprofundadamente esta quitinase, nomeadamente desenvolvendo protocolos de produção heteróloga desta proteína e purificação da mesma, assim como caracterizar esta enzima pura, focando na sua atividade, estabilidade e função. Neste estudo, a levedura Pichia pastoris GS115 foi utilizada com sucesso para a expressão extracelular de Cht3p recombinante com um rendimento de ~100 mg/L de produção. Para a remoção de proteínas contaminantes vestigiais e pigmentos presentes, foi desenvolvido um protocolo de purificação contendo 4 etapas, incluindo um tratamento com carvão ativado, uma cromatografia de interações hidrofóbicas, uma precipitação com sulfato de amónio e uma cromatografia de filtração em gel, com um rendimento de ~50 %. A caracterização desta enzima demonstrou-a ativa e estável numa ampla gama de temperaturas e pHs, com ótimos a 40-50 ºC e pH 4.5, respetivamente. Esta enzima demonstrou ser uma verdadeira quitinase, atuando especificamente em polissacarídeos de quitina e de quitosana. Usando quitina como substrato, demonstrou-se que os parâmetros cinéticos de Cht3p (Km=37.5 ± 19 mg/mL, kcat =7.5 s -1 ) estão dentro da gama demonstrada por outras quitinases. Para além disso, foi demonstrado que esta tem uma preferência por quito-oligossacarídeos de cadeia longa, assim como uma ausência de atividade em dímeros e trímeros de quito-oligossacarídeos. Os principais produtos da hidrólise são monómeros, dímeros e trímeros de quito-oligossacarídeos, demonstrando assim que esta enzima é uma endoquitinase, clivando aleatoriamente ligações internas β-(1→4) da quitina e quito-oligossacarídeos. Estes resultados irão suplementar o uso desta enzima como um antígeno no futuro desenvolvimento de uma vacina contra infeções de C. albicans.

Candida albicans is one of the most common causes of fungal infections worldwide and is the third most common cause of nosocomial bloodstream infections. It is an opportunistic pathogen that can cause both superficial and chronic infections, and in patients with a compromised immunity can lead to life threatening systemic infections with high mortality rates, reaching 50% in many cases. In a previous study aiming to identify novel vaccine antigens against infection by this organism, an uncharacterized cell wall surface chitinase, chitinase 3 (Cht3p), from C. albicans, was reported to induce an immune response against infection in treated mice. The present project aimed to investigate this chitinase further, namely, to develop heterologous protein production and purification protocols, and to characterize the purified enzyme with a focus on determining its activity, stability, and function. In this study, Pichia pastoris GS115 was successfully used as host for the extracellular expression of recombinant Cht3 with a production yield of ~100 mg/L of production culture. For removal of the trace protein contaminants and pigments present, a 4-step purification protocol with a yield of ~50 %, including activated carbon treatment, hydrophobic interactions chromatography, ammonium sulfate precipitation, and gel filtration chromatography, was developed. Characterization of the enzyme showed it to be active and stable over a relatively broad temperature and pH range, with respective optima at 40-50 ºC and pH 4.5. The enzyme was shown to be a true chitinase, being specific for the polysaccharide chitin and the chitin derivative chitosan. With chitin as substrate, it displayed kinetic parameters (Km=37.5 ± 19 mg/mL, kcat =7.5 s-1 ) within the range of those reported for other characterized chitinases. Furthermore, it was shown to have a preference for longer chain chito-oligosaccharide substrates, with no activity on chito-oligosaccharide dimers and trimers. The principal end products of hydrolysis are chito-oligosaccharide monomers, dimers, and trimers, thereby demonstrating this enzyme as being an endochitinase, randomly cleaving internal β-(1→4) linkages of chitin and chito-oligosaccharides. The results of this study will aid in the further application of this enzyme as a vaccine antigen against C. albicans infections.