Study of antifungal activity and mechanisms of action of plant extracts with potential application in sustainable agricultural practices

Abstract

O grande impacto económico proveniente de danos nas culturas agrícolas causados por fungos fitopatogénicos leva, por vezes, ao uso exacerbado e continuado de fungicidas sintéticos na agricultura convencional. Alguns destes fungicidas, caracterizados pela alta especificidade do seu mecanismo de ação, resultaram no surgimento de estirpes resistentes e também efeitos prejudiciais para o ambiente. Estudos recentes abordam os extratos de plantas como potenciais antifúngicos naturais a serem usados na agricultura orgânica, pela sua complexidade e biodegradabilidade intrínseca, contudo ainda é necessário descobrir novos extratos com atividade antifúngica e de que forma é que estes atuam. Assim, com este trabalho pretendeu-se estudar a atividade antifúngica e possíveis mecanismos de ação de extratos de plantas com potencial aplicação em práticas agrícolas sustentáveis. Através de ensaios de viabilidade foi demostrado que, dos quatro extratos etanólicos testados, Callistemon citrinus (CC), Cistus ladanifer (CL), Fraxinus angustifolia (FA) e Pistacia terebinthus (PT), Saccharomyces cerevisiae é sensível ao extrato CL em todos os tempos avaliados, em particular, após 2 h de tratamento com 400 µg/ml de CL, a percentagem de viabilidade da celular foi 71,20 % ± 4,16. Além disso, foi determinada a percentagem de inibição do crescimento do micélio (%ICM) após 9 dias de incubação com o extrato CL em fungos fitopatogénicos. Concretamente, a %ICM de Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides e Diplodia corticola foi 38,09 % ± 4,00; 30,32 % ± 4,00 e 37,4 2% ± 8,76, respetivamente, após 9 dias de incubação com o extrato CL em fungos fitopatogénicos. O estudo de possíveis mecanismos de toxicidade envolvidos nas vias de biossíntese de ergosterol, integridade da parede celular e no processo de apoptose foi realizado através de ensaios de viabilidade com as estirpes mutantes de S. cerevisiae erg2, bck1, mkk1/mkk2 e yca1 e através da análise do potencial de membrana interna mitocondrial por citometria de fluxo. As mutantes erg2, bck1 e mkk1/mkk2 foram mais sensíveis e a mutante yca1 mais resistente ao extrato CL, comparativamente à estirpe selvagem. Segundo os resultados preliminares de citometria, CL desencadeia a despolarização da membrana mitocondrial. Assim, os resultados sugerem que o extrato CL apresenta atividade antifúngica e afeta estas vias. Contudo, novos estudos, com outras mutantes, por exemplo, devem ser realizados para confirmar os resultados obtidos, sobretudo o efeito do extrato no processo de apoptose, uma vez que os resultados de citometria sugerem despolarização da membrana mitocondrial após a exposição de S. cerevisiae ao extrato CL.

The great economic impact arising from damage to agricultural crops caused by phytopathogenic fungi sometimes leads to the exacerbated and continued use of synthetic fungicides in conventional agriculture. Some of these fungicides, characterized by the high specificity of their mechanism of action, have resulted in the emergence of resistant strains and harmful effects to the environment. Recent studies approach plant extracts as potential natural antifungals to be used in organic agriculture, due to their complexity and intrinsic biodegradability, however it is still necessary to discover new extracts with antifungal activity and how they act. Thus, with this work it is intended to study the antifungal activity and possible mechanisms of action of plant extracts with potential application in sustainable agricultural practices. Through viability assays it was demonstrated that, of the four ethanolic extracts tested, Callistemon citrinus (CC), Cistus ladanifer (CL), Fraxinus angustifolia (FA) and Pistacia terebinthus (PT), Saccharomyces cerevisiae was sensitive to the extract CL in all the evaluated times, in particular, after 2h of treatment with 400 µg/ml CL (71.20 % ± 4.16 viability). Furthermore, the percentage of mycelium growth inhibition (%ICM) after 9 days of incubation with the CL extract on phytopathogenic fungi was determined. Specifically, the %ICM of Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides and Diplodia corticola were 38.09 % ± 4.00; 30.32 % ± 4.00 e 37.42 % ± 8.76, respectively, after 9 days of incubation with 500 µg/ml CL extract. The study of possible toxicity mechanisms involved in ergosterol biosynthesis pathways, cell wall integrity and apoptosis process was performed by viability assays with the erg2, bck1, mkk1/mkk2 and yca1 mutant S. cerevisiae strains and by analysis of mitochondrial inner membrane potential by flow cytometry. The erg2, bck1 and mkk1/mkk2 mutants were more sensitive and the yca1 mutant more resistant to the CL extract compared to the wild type strain. Additionally, according to preliminary cytometry results, CL triggers mitochondrial membrane depolarization. Thus, the results suggest that CL extract exhibits antifungal activity and affects these pathways. However, further studies with other mutants, for example, should be performed to confirm the results obtained, especially the effect of the extract on the apoptosis process, since cytometry results suggest mitochondrial membrane depolarization after exposure of S. cerevisiae to CL extract.