Development of genetically encoded biosensors for Plasmodium falciparum

Abstract

A malária é uma das principais doenças em todo o mundo, com mais de 200 milhões de infeções e aproximadamente 500 mil mortes associadas. A maior incidência ocorre em crianças até dos 5 anos. O P. falciparum é o Plasmodium spp mais virulento, causando a maioria das mortes e os casos mais graves da doença. Os medicamentos antimaláricos são usados mundialmente como a primeira linha de defesa. Dentro desta categoria, as terapias combinadas de artemisinina (ACTs) apresentam a maior eficácia no controlo dos sintomas e na redução da taxa de infeções. No entanto, resistência do parasita aos antimaláricos é um problema transversal aos tratamentos disponíveis. Assim, urge compreender melhor os mecanismos moleculares subjacentes à resistência aos medicamentos contra a malária. O metabolismo redox é um sitema ubíquo associado à maioria dos processos celulares. Este é crucial para o desenvolvimento do parasita, defesa antioxidante e está envolvido em mecanismos de ação e resistência a fármacos. Este, para além de essencial para a sobrevivência do parasita no ciclo assexuado, está também associado à resistência à CQ e, mais recentemente, à resistência a ACTs. Contudo, a falta de ferramentas moleculares para estudar este organismo limita o conhecimento da sua biologia, das interações parasita-hospedeiro e dos mecanismos de ação das drogas. O sensor hGrx1-roGFP2 é um biossensor fluorescente geneticamente codificado, testado com sucesso em estudos redox em P. falciparum. Tem sido descrito como uma ferramenta poderosa na compreensão do metabolismo redox do parasita, possibilitando estudos in vitro em tempo real. Tendo estas informações como base, nesta dissertação propomos o desenvolvimento de novos sensores para aprofundar o estudo dos mecanismos básicos em P. falciparum. O nosso objetivo é exportar hGrx1-roGFP2 para o eritrócito parasitado e realizar estudos de interação parasita-hospedeiro. Para isso, o sinal peptídico PEXEL - um motivo de transporte, que sinaliza proteínas para exportação - será acoplado ao sensor e integrado no genoma do parasita. O desenvolvimento de um biossensor com emissão no comprimento de onda do vermelho é também um objetivo. Se realizados com sucesso, esses sensores possibilitarão diferentes análises do comportamento redox do parasita.

Malaria is one of the major illnesses worldwide. The highest incidence occurs in children under five years. P. falciparum is the most virulent Plasmodium spp. causing the majority of the deaths and the most severe cases of the disease. Antimalarial drugs are used worldwide as a first-line defense against the disease, with the artemisinin combined therapies (ACTs) being the most effective in controlling the disease symptoms and slowing the rate of infections. However, an antimalarial resistance problem is widespread for most treatments deployed against P. falciparum. Therefore, urges to better understand the molecular mechanisms underlying drug resistance. Intracellular redox metabolism is a ubiquitous system associated with most cellular processes. This metabolism is crucial for redox balance and antioxidant defense and is involved in drug action and resistance mechanisms. Besides the fact that it is vital for erythrocytic stage survival, glutathione is also engaged in CQ resistance and, more recently, has been associated with ACTs resistance. It is crucial to better understand the biology of the parasite. However, the lack of molecular tools for this organism limits the knowledge of parasite-host interactions and mechanisms of drug action. hGrx1-roGFP2 is a fluorescent genetically encoded biosensor successfully tested in P. falciparum redox studies. It has been described as a powerful tool in understanding the parasite redox metabolism, as it makes possible in vitro real-time studies. Therefore, we propose to develop new genetically encoded biosensors to go deeper in the study of fundamental mechanisms in P. falciparum. We aim to export hGrx1-roGFP2 into the parasitized erythrocyte and perform parasite-host interaction studies. For this, the signal peptide PEXEL - a trafficking motif that signals proteins to export - will be coupled to the sensor and integrated into the P. falciparum genome. We also propose to develop a biosensor with red fluorescence emission. If successfully made, these sensors will able different analyses of the parasite redox behavior.