Evaluation of a mutation on 26S proteasome subunit of Plasmodium falciparum towards antimalarial resistance

Abstract

Malária continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo, especialmente nas regiões tropicais. Esta é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium, sendo o P. falciparum a espécie mais virulenta em humanos, devido à sua capacidade de citoaderência, obstruindo a perfusão e, consequentemente, evitando a depuração pelo sistema imunitário. Ao longo dos anos, várias terapias já foram utilizadas sendo as terapias combinadas com base na artemisinina (ACTs) as mais utilizadas atualmente. A artemisinina ativada presumivelmente gera dano celular ao reagir com os grupos suscetíveis das biomoléculas. Estas são posteriormente marcadas com ubiquitina de modo a serem reconhecidas e degradadas pelo proteossoma. No entanto, resistência à artemisinina já foi relatada e é necessário compreender os mecanismos envolvidos para não permitir que se espalhe enquanto ainda está muito localizada em regiões específicas do globo. Num laboratório parceiro, uma variante de um nucleótido foi encontrada no gene rpn2, causando a variação não-sinónima E738K, em parasitas da espécie P. chabaudi resistente a ACTs. Este projeto tem o objetivo de avaliar o impacto da variante, localizada no gene rpn2, uma subunidade da partícula regulatória 19S do proteossoma, na função fisiológica do parasita e na resposta à artemisinina. Para isso, dois plasmídeos foram construídos contendo as duas variantes E738 e 738K, usando partes do gene rpn2 do P. falciparum e a parte do P. chabaudi onde a variante está localizada. Estes genes quiméricos foram criados devido a uma homologia de 78.6% entre as proteínas das duas espécies e também devido à dificuldade associada ao manuseamento in vitro dos parasitas da espécie P. chabaudi. Nos ensaios de suscetibilidade na resposta à dihidroartemisinina (DHA), os parasitas 26S738K apresentaram maior resistência e sobrevivência em estágio de anel, comparativamente aos parasitas 26SE738. Relativamente ao impacto fisiológico, estes também apresentaram uma estabilização na atividade do proteossoma quando expostos a DHA, resultando numa redução da acumulação de proteínas poliubiquitinadas. Pelo contrário, em parasitas com a variante E738, uma diminuição da atividade do proteossoma e um aumento das proteínas após reação com DHA foi observado. Estes resultados sugerem que a variante 738K detetada em P. chabaudi confere resistência à DHA em P. falciparum e que o proteossoma está diretamente envolvido no mecanismo de resistência. Para além disso, demonstra que a via ubiquitina-proteossoma desempenha um papel importante no mecanismo de ação da DHA.

Malaria remains one of the leading causes of mortality worldwide, especially in tropical regions. This disease is caused by a protozoan parasite of the Plasmodium genus, with P. falciparum being the most virulent species capable of infecting humans due to its ability of cytoadherence, obstructing perfusion and, consequently, evading immune system clearance. Multiple therapies have been used over the years, with artemisinin-based combination therapies (ACTs) being the most widely used today. Activated artemisinin presumably generates cellular damage by reacting with the susceptible groups of biomolecules. These are posteriorly marked with ubiquitin to be recognized and degraded by the 26S proteasome. However, artemisinin resistance has emerged, and it is necessary to understand its mechanisms not to allow its spread while it is very located. A partner group laboratory found a single nucleotide variant (SNV), causing a non-synonymous mutation, the E738K, in the rpn2 gene, on ACT resistant P. chabaudi parasites. Therefore, this project aimed to evaluate the impact of the E378K variant, located in the rpn2 gene, a subunit of the 19S regulatory particle of the 26S proteasome, on the proteasome function in the parasite life cycle and in the artemisinin response. Two plasmids were constructed bearing the E738 and 738K variants, using parts of the P. falciparum rpn2 gene and the part of the P. chabaudi rpn2 gene where the variant is located. These chimeric genes were created due to a 78.6% homology between the proteins of both species and the impossibility to culture P. chabaudi parasite in vitro. Drug susceptibility assays showed that the 26S738K parasites presented a higher IC50 and higher parasite survival in the ring-stage survival assay (RSA), compared to the 26SE738 parasites, in the artemisinin response. Additionally, they presented a stabilization in the proteasome activity when challenged to dihydroartemisinin (DHA) and consequent reduction of polyubiquitinated proteins accumulation. On the contrary, E738 parasites showed a decrease in the proteasome activity and increased polyubiquitinated proteins upon reaction with DHA. These results suggest that the 738K variant confer DHA resistance to the parasites and that the proteasome is involved in this DHA resistance. Moreover, it demonstrates that the ubiquitin-proteasome pathway plays an important role in the DHA mechanism of action.