Influence of host-pathogen genetic variants on malaria chemotherapy

Abstract

Malaria is still a disease of major concern globally. In 2017, the malaria incidence was of 219 million cases and 435,000 people died because of it. Five parasites species of the genus Plasmodium cause the ailment in humans. Out of these, P. falciparum and P. vivax are responsible for most cases. Dominican Republic (DR) is a malaria endemic country that is now under the elimination phase. In DR, as malaria prevalence declines, the proportion of cases that fall below the detection level of standard malaria diagnosis (rapid diagnostic tests (RDTs) or microscopy) might be increasing, underlining the need of including more sensitive diagnostic methods such as molecular tools like PCR and LAMP. Furthermore, DR is one of the few countries in the world where chloroquine together with primaquine is used as the first-line treatment for uncomplicated P. falciparum malaria. This treatment is still clinically effective in DR, even though the world is struggling with resistance to newer antimalarials. The aim of this thesis is to understand the influence of host-pathogen genetic variants on malaria chemotherapy with emphasis on the DR situation. We have genotyped the Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase A- allele, a predictor of possible hemolytic anemia due primaquine treatment, in Dominican subjects and found a high prevalence of this allele circulating in DR. Nevertheless, there is no side effects reported in DR upon primaquine treatment concluding that the dose used in DR is safe even in subjects with Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase A- allele. In the same subset of samples, that through malaria standard diagnostic tests did not detect the malaria parasite, we explored for malaria positivity through molecular genotyping. We detected a high percentage (20%) of false negatives highlignting the need to change to more sensitive diagnostics tests in the country. We genotyped the false negative for chloroquine resistance markers and detected mutations on the pfcrt and pfmdr1 genes. This is the first report showing the presence of this mutations in the country. In this thesis work we have also attempt to gene edit, through selection linked integration (SLI) system the pfcrt to allelic exchange the mutation found and to exchange pfmdr1 on P. falciparum 3D7 strain by its orthologue pvmdr1 as a proof of concept that it is possible to use P. falciparum as a vehicle to study P. vivax genes.

A malária ainda é uma doença de grande preocupação global. Em 2017, a incidência da malária foi de 219 milhões de casos e 435.000 pessoas morreram devido à mesma. Cinco parasitas do género Plasmodium causam doença em humanos. Destes, P. falciparum seguido de P. vivax são responsáveis pela maioria dos casos. A República Dominicana (RD) é um país endémico da malária que está agora em fase de eliminação. Na RD, a prevalência da malária tem vindo a decrescer, aumentando a proporção de casos abaixo do nível de detecção do diagnóstico padrão da malária (testes de diagnóstico rápido (TDR) ou microscopia), alertando para a necessidade de métodos diagnósticos mais sensíveis como ferramentas moleculares (PCR e LAMP). Além disso, a RD é um dos poucos países do mundo onde a cloroquina juntamente com a primaquina constituem o tratamento de primeira linha para malária não complicada por P. falciparum. Na DR este tratamento ainda é clinicamente eficaz, embora o resto do mundo tenha problemas deresistência a antimaláricos ainda mais actuais. O objetivo desta tese é compreender a influência das variantes genéticas do patógeno-hospedeiro na quimioterapia da malária, com ênfase na situação da RD. Para avaliar o risco de anemia hemolítica devido a tratamento com primaquina, analisámos a prevalência da deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase em indivíduos Dominicanos através de genotipagem do alelo G6PD A-, tendo-se observado uma elevada prevalência deste alelo. Contudo, não existem efeitos secundários reportados na RD após tratamento com primaquina, pelo que a dose usada é segura, mesmo em sujeitos portadores de G6PD A-. No mesmo subconjunto e para amostras onde os testes de diagnóstico padrão não detectaram o parasita da malária, estas foram testada para positividade de malária através de genotipagem molecular. Detectando cerca de 20% de positividade para P. falciparum neste conjunto de amostras, analisamos os marcadores de resistência à cloroquina nos genes pfmdr1 e pfcrt. Na tentativa de entender melhor a interação entre os genes pfcrt e pfmdr1 e o impacto de diferentes variantes na resistência aos antimaláricos, estirpes adaptadas em laboratório foram geneticamente editadas usando uma ferramenta de edição do genoma recentemente descrita, denominada integração ligada à seleção (SLI). Finalmente, para melhor compreender os mecanismos de resistência a drogas em P. vivax, dado que esta espécie de Plasmodium provou ser difícil crescer in vitro, tentámos substituir o pfmdr1 em P. falciparum 3D7 pelo seu ortólogo pvmdr1, usando SLI como prova de conceito de que é possível usar o P. falciparum como veículo para o estudo dos genes de P. vivax.