Development of targeted delivery platforms against highly metastatic cancers

Abstract

O cancro é uma das principais causas de morbidade e mortalidade a nível mundial, e as suas metástases são responsáveis por cerca de 90% das mortes. As atuais abordagens terapêuticas têm baixas taxas de sucesso em casos de doença metastática e a maioria dos pacientes não pode ser curada. Portanto, é crucial encontrar novas estratégias para desenvolver terapias eficientes dirigidas ao alvo. As tecnologias baseadas na seleção de aptâmeros facilitaram a descoberta de novos biomarcadores, especialmente através da tecnologia cell-SELEX, que permite a identificação de ligandos para um tipo específico de células. Deste modo, essa tecnologia foi usada para identificar um aptâmero específico para a linha celular metastática de osteossarcoma MG-63. O aptâmero mais promissor (OS-7.9) foi selecionado através de análise bioinformática, e os ensaios in vitro demonstraram a sua alta afinidade para as células-alvo, bem como para células de órgãos para os quais o osteossarcoma tem tendência a metastizar. Além disso, a tecnologia cell-SELEX foi utilizada em combinação com a sequenciação de nova geração e análise bioinformática para identificar sequências de aptâmeros (Apt1 e Apt2) com alta afinidade e especificidade para a linha celular metastática de cancro de mama (CM) MDA-MB-231. A possível translação clínica também ficou demonstrada para o Apt2 através da utilização de secções de tecido de CM. No que diz respeito aos nanossistemas de entrega de agentes terapêuticos, os sistemas não virais foram os selecionados devido à sua segurança para aplicações biomédicas. Sistemas de lipossomas catiónicos foram avaliados para o transporte de plasmídeos CRISPR/Cas9 e consequente terapia genética na linha celular usada para validação, as HEK 293T. Ensaios in vitro demonstraram elevada eficiência de transfeção e capacidade de disrupção de genes por lipoplexos à base de lípido MVL5. Estudos sobre a disrupção do microRNA-155 na linha metastática de CM Hs 578T revelaram uma ativação dos marcadores apoptóticos, bem como um aumento da paragem do ciclo celular na fase G2/M e inibição da migração. Também foram usados exossomas para a entrega de plasmídeos CRISPR/Cas9, devido à capacidade natural destas vesículas de transportar material genético. Os exossomas foram modificados com um péptido que reconhece especificamente o recetor EGFR (péptido GE11) para melhorar a internalização celular em células de CM que expressam este recetor. No geral, os resultados obtidos nesta dissertação contribuíram para o objetivo de desenvolver novas abordagens terapêuticas para cancro metastático através da identificação de novos ligandos específicos para posterior incorporação em nanossistemas de entrega, tais como lipossomas e exossomas que têm capacidade de transportar plasmídeos CRISPR/Cas9 para a aplicações de terapia genética em cancro.

Cancer is a major cause of morbidity and mortality worldwide, and metastasis accounts for about 90% of cancer-related deaths. Current therapeutic approaches have poor outcomes in metastatic disease and most patients cannot be cured. Therefore, finding novel strategies is crucial for the development of new effective targeted therapies. Aptamer-based technologies have facilitated biomarker discovery, especially through cell-SELEX technology, through the identification of cell-specific ligands. Hence, this technology was used to generate an aptamer homing the highly metastatic MG-63 osteosarcoma cell line. The most promising aptamer (OS-7.9) was selected through bioinformatic analysis and in vitro assays demonstrating high affinity against the target cells, as well as against cells from common OS-metastatic sites. Moreover, the combination of cell-SELEX technology with high-throughput sequencing aided by bioinformatic analysis led to the identification of aptamer sequences (Apt1 and Apt2) with high affinity and specificity towards the metastatic breast cancer cell line MDA-MB-231. Additionally, clinical translational applicability was proven for Apt2 using breast tumor tissue sections. Regarding drug delivery systems, non-viral delivery systems were exploited due to their biosafety. Therefore, different cationic liposome formulations were evaluated for the loading of CRISPR/Cas9 plasmids and consequent gene therapy in the proof-of-concept cell line HEK 293T. In vitro assays demonstrated high transfection efficiency and gene knockout ability by MVL5-based cationic lipoplexes. Next, some preliminary data on the disruption of miR-155 in the metastatic cancer cell line Hs 578T by CRISPR/Cas9 technology showed an activation of apoptotic markers as well as an induction of G2/M cell cycle arrest, and cell migration inhibition. Ultimately, exosomes were also used as gene delivery platforms due to their natural ability to transfer genetic material. Exosomes were successfully modified with a peptide that targets EGFR receptor (GE11 peptide) to improve the cellular uptake to efficiently deliver CRISPR/Cas9 plasmids in EGFRexpressing breast cancer cells. Overall, the results gathered in this thesis contributed to the goal of developing novel therapeutic approaches for metastatic cancers through the identification of novel specific ligands for highly metastatic cancer, for posterior incorporation into gene delivery platforms such as multivalent cationic liposomes and exosomes that can carry CRISPR/Cas9 plasmids for gene cancer therapy.