Development of a cell factory for the production of tyrosol and its derivatives from shikimate pathway

Abstract

For thousands of years, humankind has intuitively used plant-based products in their diet and in medical purposes. It is the case of olive oil in southern Europe and the Middle East or the green tea in Asia. One of the active compounds of these foods and medicines are phenylethanoids, which are well- known as useful antioxidants that protect cells and tissues from oxidative injury, which can cause forms of dementia like Parkinson’s or Alzheimer’s disease, cancer and heart disease. Tyrosol, hydroxytyrosol, and salidroside are typical phenylethanoids found in plants and have various biological activities. Tyrosol is a key-point product that can be converted into hydroxytyrosol and salidroside. The concentration of these compounds in plants is usually low which makes plant extraction cost-prohibited, while production by chemical synthesis has low yields and generates toxic compounds. For these reasons, new approaches to cost-efficiently produce these compounds at considerable high yields are needed to fulfil the necessities. The mentioned properties along with the fact that they are compounds with extremely high commercial value, make their biosynthesis by biotechnology means attractive. In this thesis, we systematically evaluated the effects of the expression of critical genes on the synthesis of compounds tyrosol, hydroxytyrosol and salidroside, along with the effects of some gene knockouts to improve the carbon flux. The host organism chosen was the workhorse Escherichia coli and the metabolic strategy included the overexpression of genes to allow the accumulation of tyrosol, improve precursor’s synthesis and the deletion of genes from competing pathways. Next, the genes whose enzymes catalyse the formation of hydroxytyrosol and salidroside were added to the tyrosol producing strains and its expression was optimized to enable full conversion of tyrosol. In the end, with a simple strategy, it was possible to achieve the same amount of tyrosol as reported before and record values of hydroxytyrosol and salidroside. These results are a step forward towards the industrialization of tyrosol, hydroxytyrosol and salidroside.

Durante milhares de anos, a humanidade utilizou intuitivamente produtos à base de plantas na sua alimentação e para fins medicinais. Alguns exemplos são o azeite que é utilizado no sul da Europa e no Médio Oriente e o chá verde usado na Ásia. Um dos compostos ativos destes alimentos e medicamentos são os feniletanóides, que são conhecidos como bons antioxidantes que protegem as células e os tecidos de oxidação, que pode levar ao desenvolvimento de formas de demência tais como a doença de Parkinson e de Alzheimer, cancro e doenças cardiovasculares. O tirosol, o hidroxitirosol e a salidrosina são feniletanóides que podem ser encontrados em algumas plantas e possuem várias propriedades biológicas. O tirosol é um produto chave que pode ser convertido em hidroxitirosol e salidrosina. A concentração destes compostos nas plantas é geralmente baixa, elevando muito os custos da sua extração, enquanto que a sua produção por síntese química está associada a baixos rendimentos e à produção de compostos secundários tóxicos. Desta forma, são necessárias novas estratégias mais eficazes e de custo reduzido para a produção destes compostos. Por outro lado, as propriedades anteriormente mencionadas associadas ao facto destes compostos terem elevado interesse económico, tornam atrativa a sua biossíntese por biotecnologia. Nesta tese, avaliamos sistematicamente os efeitos da expressão de genes críticos na síntese dos compostos tirosol, hidroxitirosol e salidrosina, bem como os efeitos de algumas deleções de genes com o intuito de melhorar o fluxo de carbono. O microrganismo selecionado foi a Escherichia coli e a estratégia metabólica envolveu a sobreexpressão de genes que permitem a acumulação de tirosol, a melhoria da síntese de percursores e a deleção de genes de vias competitivas. De seguida, os genes cujas enzimas catalisam a formação de hidroxitirosol e salidrosina foram adicionados às estirpes produtoras de tirosol e a sua expressão foi otimizada para permitir a conversão total do tirosol. No final, com uma estratégia simples, foi possível obter a mesma quantidade de tirosol relatada anteriormente e superar os valores de hidroxitirosol e salidrosina. Desta forma, estes resultados são um passo em frente na industrialização do tirosol, hidroxitirosol e salidrosina.