Toxicity of metals in aquatic hyphomycetes : cellular targets and defense mechanisms

Abstract

Human activities contribute to a high release of heavy metals to the environment at rates and concentrations sufficient to make them pollutants. Certain metals, such as Cu and Zn, are needed for the growth and metabolism of organisms, while others, as Cd, have no recognized biological functions. However, above critical levels, both essential and non-essential metals became toxic to living organisms. Aquatic hyphomycetes are a polyphyletic group of fungi that play a key role in plant-litter decomposition in streams. They produce an array of exoenzymes able to degrade plant cell-wall polymers and increase plant-litter palatability for invertebrate detritivores. Even though these fungi occur in metal-polluted streams, the mechanisms underlying their resistance/tolerance to metals are poorly documented. In this study, the exposure to metals inhibited reproduction, as sporulation rates, of the aquatic hyphomycetes. Moreover, fungal reproduction was more sensitive to metals than growth. The sensitivity of aquatic hyphomycetes to metals, assessed as the metal concentration inhibiting biomass production in 50% (EC50), showed that Ypsilina graminea and Varicosporium elodeae were the most resistant species to Zn, while Heliscus submersus was the most resistant to Cu. The EC50 values were about 20-times higher in solid medium than in liquid medium. However, the patterns of species resistance to metals in either liquid or solid medium, with similar composition, were identical. Generally, Ni or Cd were more toxic than Zn or Cu to fungi. H. submersus and V. elodeae had remarkable ability to adsorb Cu and Zn, respectively. Because these fungal species were highly tolerant to each metal, biosorption may be a relevant mechanism to avoid unrestrained uptake of metals. We demonstrated that the generation/accumulation of reactive oxygen species (ROS) contributed noticeably to metal toxicity in aquatic hyphomycetes, particularly under Cu stress, as indicated by a recovery in biomass production by the presence of an antioxidant agent. Our results showed that plasma membrane integrity of V. elodeae and H. submersus was more affected by Cu than Zn, pointing to this cellular structure as a potentially vulnerable target of Cu. At short-term (10 min), Cu completely inhibited the activity of the plasma membrane H+-ATPase of H. submersus and V. elodeae, while Zn only led to a similar effect on that of H. submersus. However, a recovery of plasma membrane integrity was observed after 150 min of metal exposure. A strong stimulation of the proton pump was found in the most tolerant species (i.e. when H. submersus was exposed to Cu and V. elodeae was exposed to Zn) at longer times (8 days). The activation of H+-ATPase may contribute to counteract metal-induced dissipation of the electrochemical gradient of protons across the plasma membrane, suggesting that H+- ATPase may be involved in aquatic hyphomycete acclimation to metals. Our studies on antioxidant defenses showed that catalase had a greater role in alleviating the stress induced by Cu and Zn than superoxide dismutase. In addition, the increased activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase, after long-term exposure to metals (8 days), points to the involvement of the pentose phosphate pathway in metal acclimation. Before metal exposure, H. submersus and Flagellospora curta isolated from a metal-polluted stream had higher levels of thiol compounds than V. elodeae, isolated from a clean stream. However, the latter species rapidly increased the levels of thiols after metal exposure. These findings are in agreement with the recognized role of thiol compounds as metal sequesters and/or ROS scavengers. Finally, we showed that Cu and Zn are able to induce programmed cell death (PCD) in aquatic hyphomycetes, a process in which cells actively participate in their own death. The exposure to Cu promoted ROS production and caspase activation in H. submersus and F. curta. Conversely, under Zn stress, aquatic hyphomycetes showed high number of cells with nuclear morphological alterations and/or DNA strand-breaks. The different pattern of PCD markers suggests that the triggering cell death signal is most probably related to different cellular targets for Cu and Zn in aquatic hyphomycetes.

As actividades humanas contribuem para o aumento da libertação de metais pesados para o ambiente, a taxas e a concentrações que os tornam poluentes. Alguns metais, como o Cu e o Zn, são necessários para o crescimento e metabolismo dos organismos, enquanto que outros, como o Cd, não lhes é atribuída qualquer função biológica. Contudo, acima de certas concentrações, os metais, quer os essenciais quer os não essenciais, tornam-se tóxicos para os organismos vivos. Os hifomicetos aquáticos são um grupo de fungos filogeneticamente heterogéneo que desempenham um papel chave na decomposição dos detritos vegetais nos rios. Estes fungos produzem um conjunto de enzimas extracelulares capazes de degradar os polímeros das paredes das células vegetais aumentando a palatabilidade dos detritos vegetais para os invertebrados detritívoros. Apesar dos hifomicetos aquáticos estarem presentes quer em rios de referência quer em rios poluídos com metais pesados, os mecanismos subjacentes à sua resistência/tolerância aos metais são pouco conhecidos. Neste estudo, a reprodução dos fungos, avaliada pela taxa de esporulação, foi inibida pela exposição aos metais. Além disso, a reprodução dos fungos foi mais sensível aos efeitos negativos dos metais do que o seu crescimento. A sensibilidade dos hifomicetos aquáticos aos metais, avaliada pela concentração de metal capaz de inibir a produção de biomassa em 50% (EC50), mostrou que Ypsilina graminea e Varicosporium elodeae foram as espécies mais resistentes ao Zn, enquanto que Heliscus submersus foi a mais resistente ao Cu. Os valores de EC50 foram cerca de 20 vezes mais elevados em meio sólido do que em meio líquido. Porém, os padrões de resistência aos metais exibidos pelos hifomicetos aquáticos foram semelhantes em meio sólido ou em meioo líquido com idêntica composição química. Geralmente, o Ni ou o Cd foram mais tóxicos do que o Zn ou o Cu. H. submersus e V. elodeae exibiram capacidade elevada para adsorver, respectivamente, Cu e Zn. Dado que estes fungos foram muito tolerantes a esses metais, a bioadsorção pode constituir um mecanismo relevante para controlar a entrada dos metais nas células. Neste trabalho demonstrámos que a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) contribuiu notavelmente para a toxicidade dos metais, sobretudo no caso do Cu, como indicado pela recuperação da biomassa produzida pelos fungos na presença de um agente antioxidante. A integridade da membrana plasmática de V. elodeae e de H. submersus foi mais afectada pelo Cu do que pelo Zn, sugerindo que esta estrutura celular pode ser um alvo potencial para o Cu. A tempos curtos de exposição (10 min), o Cu bloqueou a actividade da H+-ATPase da membrana plasmática de H. submersus e de V. elodeae, enquanto que o Zn só promoveu um efeito semelhante em H. submersus. Contudo, uma recuperação da integridade da membrana plasmática foi observada a tempos mais longos (150 min). Após 8 dias de exposição, um estímulo forte da bomba de protões foi encontrado nas espécies mais tolerantes, i.e. em H. submersus exposto a Cu e em V. elodeae exposto a Zn. A activação da H+-ATPase pode contribuir para contrabalançar a dissipação do gradiente electroquímico de protões induzida pelo metal, sugerindo o envolvimento desta bomba na aclimatação dos fungos ao stress metálico. Os nossos estudos sobre as defesas antioxidantes mostraram que a catalase teve um papel mais importante do que a superóxido dismutase na mitigação do stress induzido pelo Cu e pelo Zn. Além disso, o estímulo da actividade da glucose-6-fosfato desidrogenase após 8 dias de exposição aos metais, sugere o envolvimento da via das pentoses na aclimatação dos fungos aos metais. As espécies H. submersus e Flagellospora curta, isoladas de um rio poluído com metais, tinham níveis mais elevados de compostos ricos em grupos tiol do que a espécie V. elodeae, isolada de um rio de referência. Contudo, esta última espécie aumentou rapidamente o seu conteúdo em compostos tiólicos após a exposição ao metal. Estes resultados estão de acordo com o reconhecido papel dos compostos tiólicos na sequestração de metal e/ou ROS nas células. Finalmente, os nossos resultados mostraram que o Cu e o Zn foram capazes de induzir morte celular programada (PCD) em hifomicetos aquáticos, um processo de morte celular activa. O stress induzido pelo Cu estimulou sobretudo a produção de ROS e a actividade das caspases em H. submersus e em F. curta. Por outro lado, os hifomicetos aquáticos expostos a Zn mostraram um elevado número de células com alterações morfológicas no núcleo e/ou quebras na cadeia de DNA. O diferente padrão de resposta dos marcadores de PCD sugere que o sinal de morte celular pode estar relacionado com diferentes alvos celulares do Cu e do Zn em hifomicetos aquáticos.