Development of a biosensor for detection of cancer biomarkers

Abstract

Com o avanço tecnológico na área da oncologia, os biomarcadores existentes em sinergia com as técnicas convencionais de diagnostico têm permitido deteção precoce desta patologia. Ainda assim, quando se debruça sobre o panorama clínico a nível nacional, observa-se que estas técnicas constituem um processo moroso, dispendioso, muitas vezes acarretando elevado desconforto ao paciente. Num aspeto mais global, também é evidente que o acesso a instalações apropriadas, com equipamento e pessoal especializado para diagnóstico está diretamente relacionado com a taxa de sobrevivência à doença. Deste modo, torna-se imprescindível encontrar respostas de diagnóstico que permitam a deteção precoce em qualquer parte do mundo. Neste trabalho são apresentadas novas moléculas com potencial como elementos de reconhecimento na deteção de cancro e duas estratégias de deteção de biomarcadores de cancro. O aumento de evidências das células tumorais circulantes como valiosos biomarcadores serviram de motivação para isolar um novo péptido com potencial como elemento de reconhecimento das SK-BR-3, uma linha tumoral de mama, com recurso à técnica de Phage Display. Ferramentas de bioinformática permitiram caracterizar o péptido e ensaios de citometria permitiram a sua validação para a linha celular alvo. Foi posteriormente desenvolvido um sensor eletroquímico, com recurso a elétrodos de ouro convencionais, aplicando este péptido como elemento de reconhecimento. Ensaios preliminares de afinidade e cinética mostraram potencial para esta estratégia na deteção da linha tumoral alvo em suspensão. Usando a técnica de SELEX, foi possível identificar um novo aptâmero com afinidade para a Catepsina B. Este aptâmero foi caracterizado por recurso a ferramentas de bioinformática e os ensaios de fluorescência corroboraram os resultados de docking molecular. As vantagens do uso de aptâmeros como elementos de reconhecimento e do uso de papel como elemento de suporte na construção de sensores inspiraram a construção de um sensor colorimétrico. Este sensor emprega um aptâmero com especificidade para a Osteopontina e incorpora o revelador de cor na sua construção, simplificando o seu uso em contexto de análise.

With the technological advances in the area of oncology, the existing biomarkers in synergy with conventional diagnostic methods have allowed early detection of this pathology, in agreement to what the World Health Organization considers, up to date, the most effective measure to fight this disease. Even so, when looking at the clinical scenario at the national level, it is observed that these techniques are time-consuming, costly, often causing great discomfort to the patient. In a more global aspect, it is also evident that access to appropriate facilities, with specialized equipment and personnel for diagnosis is directly related to the overall survival for this disease. Thus, it is essential to find diagnostic solutions that allow early detection anywhere in the world. In this work two new molecules with potential as recognition elements in cancer and two strategies for cancer biomarkers’ detection are presented. The increasing evidence of circulating tumor cells as valuable biomarkers served as motivation to isolate a new peptide with potential as a recognition element of SK-BR-3, a breast tumor line, using the Phage Display technique. Bioinformatics tools allowed to characterize the peptide and cytometry assays allowed its validation for the target cell line. This peptide was then used to construct an electrochemical sensor using conventional gold electrodes. Preliminary affinity assays and kinetic studies allowed to successfully detect the target tumor line in suspension. Using the SELEX technique, it was possible to identify a new aptamer with affinity for Cathepsin B. This aptamer was further characterized with bioinformatics tools and the fluorescence assays corroborated the molecular docking results. The advantages of using aptamers as recognition elements and of paper as a support element in the construction of sensors inspired the construction of a colorimetric device. This sensor employs an aptamer with specificity for Osteopontin and incorporates the color developer in its construction, simplifying its use in the context of analysis.