Exploring the potential of newly-identified miRNA-encoded peptides to improve the production of bioactive secondary metabolites in grape cells

Abstract

The global quality and characteristics of grape berries, and ultimately of wine, are influenced by their polyphenolic composition. Therefore, potential strategies to improve berry quality by targeting secondary metabolism pathways of phenolic compound synthesis are useful, particularly in an ongoing context of climate change. These pathways are modulated by several molecular mechanisms, including regulation of gene transcription by specific transcription factors and post-transcriptional regulation by microRNAs. Recently, it was discovered that the primary (non-mature) miRNAs transcripts (pri-miRNAs) could encode for small regulatory peptides (micropeptides – miPEPs). In a positive loop, these miRNA-encoded peptides enhance the transcription and accumulation of their corresponding pri-miRNAs and, consequently, of their mature miRNAs, subsequently leading to an accentuated negative regulation of miRNA-regulated target genes. The objective of this work was to explore this recent discovery and to experiment the exogenous application of a micropeptide (miPEP396a) that putatively promotes the inhibition of the transcription factor VvMYB5b, an activator of the expression of several genes involved in the flavonoid pathway. Designated in this study as miPEP-MYB5b, this micropeptide may serve as a fine-tuning tool for modulation of secondary metabolic pathways in grape berry cells and, consequently, improve their global quality-traits. MiPEP-MYB5b was identified in silico and exogenously added to a Gamay Freaux grape berry cells in two different concentrations (0.1 μM and 0.5 μM). Its effect in the concentration of secondary metabolites such as anthocyanins, total flavonoids, total phenolics and stilbenes as well as in the transcription of key genes involved in biosynthetic routes that produce secondary metabolites with bioactive properties and important for grape berry quality, particularly in flavonoid- and stilbene-synthesizing pathways was analyzed. Both concentrations of miPEP-MYB5b resulted in downregulation of key genes involved in the flavonoid pathway, such as VvLAR1, VvLAR2, and VvCHI, while 0.5 μM resulted in downregulation of flavonoid-related genes VvANR, VvFLS1, VvCHS1. A parallel stimulation of the expression of the stilbene-synthesizing gene VvSTS1 was also observed in miPEP-treated cells. This upregulation of the stilbene pathway was probably due to a miPEP-MYB5b-mediated inhibition of MYB5b and, thus, of the flavonoid pathway, that competes directly with the stilbene pathway for substrate. Concordantly with the inhibition of the flavonoid pathway and stimulation of the stilbene pathway, a higher stilbene content and lower concentration of flavonoids (including anthocyanins) were quantified in grape berry cells. Thus, miPEP-MYB5b exogenous application may be a promising strategy to modulate secondary metabolic pathways in order to produce and accumulate higher quantity of stilbenes in grape berry cells in a near future, by exploring mechanisms of microRNA-mediated gene regulation in plants.

A qualidade e características globais dos bagos de uva e do vinho são influenciadas pela composição em polifenólicos. Por isso, estratégias que melhorem a qualidade dos bagos tendo como alvo as vias do metabolismo secundário que sintetizem compostos fenólicos são úteis, particularmente, no contexto atual das alterações climáticas. Estas vias são moduladas por vários mecanismos moleculares, incluindo a regulação da transcrição de genes através de fatores de transcrição específicos e regulação pós-transcricional através de microRNAs. Recentemente, descobriu-se que os transcritos primários (não-maduros) dos miRNAs codificam pequenos péptidos reguladores (micropéptidos- miPEPs). Num “loop” positivo, estes micropéptidos aumentam a transcrição e a acumulação do pri-miRNA e miRNA correspondentes e, posteriormente, levam a uma regulação negativa dos genes alvo de uma forma mais acentuada. O objetivo deste trabalho consistiu em explorar esta recente descoberta e experimentar a aplicação exógena de um micropéptido (miPEP396a) que, putativamente, promove a inibição do fator de transcrição VvMYB5b, um ativador da expressão de vários genes envolvidos na via dos flavonoides. Designado por miPEP-MYB5b neste estudo, este micropéptido poderá permitir a manipulação das vias do metabolismo secundário nas células dos bagos e, consequentemente, melhorar a sua qualidade global. O miPEP-MYB5b foi identificado in silico e depois adicionado a uma cultura celular de bagos da variedade Gamay Freaux, em duas concentrações diferentes (0,1 μM e 0,5 μM), sendo analisado o seu efeito na concentração de metabolitos secundários como antocianinas, flavonoides totais, fenólicos totais e stilbenos, bem como na transcrição de genes-chaves envolvidos nas vias metabólicas que produzem estes compostos secundários com propriedades bioativas e de grande importância para a qualidade dos bagos, particularmente nas vidas de síntese de flavonoides e stilbenos. Ambas as concentrações de micropéptido levaram à regulação negativa dos genes VvLAR1, VvLAR2 e VvCHI, enquanto a 0,5 μM provocaram uma regulação negativa de genes relacionados com a via dos flavonoides, como VvANR, VvFLS1 e VvCHS1. Foi também observada uma estimulação da expressão do gene VvSTS1, responsável pela síntese de stilbenos, em células tratadas com o micropéptido. Esta regulação positiva da via dos stilbenos ocorreu, provavelmente, devido a uma inibição do MYB5b mediada pelo micropéptido que, em consequência, inibiu a via dos flavonoides, que compete por substrato diretamente com a via dos stilbenos. Para além da inibição da via dos flavonoides e estimulação da via dos stilbenos, detetaram-se maiores quantidades de stilbenos e menor concentração de flavonoides (incluindo antocianinas) em células de bagos de uva. Desta forma, a aplicação exógena do miPEP-MYB5b poderá ser uma estratégia promissora para modular as vias do metabolismo secundário para produzir e acumular mais stilbenos em células dos bagos de uva, explorando os mecanismos de regulação genética mediados por miRNAs em plantas.