Exploring miRNA-encoded peptides (miPEPs) as a tool for modulating characteristics of grape berry cells

Abstract

Grapevine cultivation is highly influenced by biotic and abiotic stress factors that affect its productivity and the quality of the grape berry, resulting in major economic losses. Secondary metabolic pathways in grape berries, mainly polyphenolic pathways, are responsible for wine quality-traits such as flavor, texture, color, astringency and aroma, due to the production of phenolic compounds. Thus, potential strategies to increase berry quality by targeting these pathways are important in a context of environmental adversity. These pathways are tightly regulated by an array of molecular mechanisms, including activation of gene transcription by specific transcription factors and post-transcriptional regulation in multiple forms, as, for instance, by microRNAs. It was recently found that, before being processed into mature miRNAs, the primary transcripts of miRNAs (pri-miRNAs) could encode for small regulatory peptides, thus designated miRNA-encoded peptides (micropeptides - miPEPs). These miPEPs enhance the transcription and accumulation of the corresponding pri-miRNA and, thus, of the mature miRNA, in a positive feedback loop, that subsequently lead to an accentuated downregulation of the respective miRNA-targeted genes. The objective of this work was to take advantage of this recent breakthrough and to validate the exogenous application of miPEPs as a tool for modulating secondary metabolic pathways in grape berry cells, thus, their quality-traits. For that, three candidate micropeptides, miPEP-UFGT1 (miPEP3631a), miPEP-MYB5b (miPEP396a) and miPEP-MYBPA1 (miPEP164c), screened and identified in silico were exogenously added to Gamay Freaux grape berry cells and molecular biology and classic biochemical approaches were performed to assess the influence of these miPEPs on the transcription of key genes involved in secondary metabolic pathways associated with grape berry quality, as well as on the biochemical activity of the corresponding enzymes, and on the final concentration of secondary metabolites such as anthocyanins, proanthocyanidins and total phenolics. The exogenous application of the miPEP ultimately targeting transcription factor MYBPA1 (miPEP-MYBPA1) resulted in a strong up-regulation of genes involved in anthocyanin synthesis (VvUFGT1), transport and accumulation in the vacuole (VvMATE1 and VvGST4) as well as on the biochemical activity of UFGT. This was probably because, simultaneously, miPEP-MYBPA1 led to a miR164c-mediated downregulation of the proanthocyanidin-biosynthetic pathway, one that directly competes for substrate with the anthocyanin-biosynthetic pathway, by inducing a decrease in VvLAR1 expression and LAR biochemical activity, and also in proanthocyanidin concentration. Thus, miPEP-MYBPA1 application is a new and promising strategy to modulate secondary metabolic pathways in grape berry cells towards the synthesis and accumulation of more anthocyanins, by taking advantage of plant miRNA-mediated regulatory mechanisms.

O cultivo da videira é altamente influenciado por fatores de stresse bióticos e abióticos que afetam a sua produtividade e a qualidade da uva, resultando em grandes perdas económicas. As vias metabólicas secundárias nos bagos de uva, principalmente as de síntese de polifenólicos, são responsáveis por características que conferem qualidade ao vinho, como o sabor, a textura, a cor, a adstringência e o aroma, devido à produção de compostos fenólicos. Desta forma, estratégias que levem ao aumento da qualidade do bago de uva ao influenciarem estas vias são de elevada importância num contexto de adversidade ambiental. Estas vias metabólicas são reguladas por uma série de mecanismos moleculares, incluindo a ativação da transcrição de genes por fatores de transcrição específicos, mas também a regulação póstranscricional que ocorre de várias formas como, por exemplo, através da ação de microRNAs. Foi recentemente descoberto que, antes de serem processados na sua forma madura, os transcritos primários dos miRNAs (pri-miRNAs) podiam codificar pequenos péptidos reguladores, sendo por isso denominados como péptidos codificados por miRNA (micropéptidos - miPEPs). Estes miPEPs aumentam a transcrição e acumulação do seu transcrito primário e, assim, da forma madura do miRNA, num loop de feedback positivo que, consequentemente leva a uma acentuada regulação negativa dos respetivos genes alvo. O objetivo deste trabalho consistiu em tirar partido deste recente avanço e validar a aplicação exógena de miPEPs como ferramenta para modular as vias do metabolismo secundário em células de bago de uva, melhorando assim as características que lhe conferem qualidade. Para isso, três micropéptidos candidatos, miPEP-UFGT1 (miPEP3631a), miPEPMYB5b (miPEP396a) e miPEP-MYBPA1 (miPEP164c), perscrutados e identificados in silico foram adicionados exogenamente a culturas celulares provenientes de bagos da variedade Gamay Freaux e realizaram-se abordagens de biologia molecular e de bioquímica convencional para avaliar a influência destes miPEPs na transcrição de genes-chave envolvidos nas vias metabólicas secundárias associadas à qualidade da uva, bem como na atividade bioquímica das enzimas correspondentes e na concentração final de metabólitos secundários, como antocianinas, proantocianidinas e fenólicos totais. A aplicação exógena do micropéptido que tem como alvo o fator de transcrição MYBPA1 (miPEP-MYBPA1), resultou numa forte regulação positiva de genes envolvidos na síntese de antocianinas (VvUFGT1), no seu transporte e acumulação no vacúolo (vMATE1 e VvGST4), assim como na atividade bioquímica da enzima UFGT. Isto deveu-se, provavelmente, ao facto do miPEP-MYBPA1 ter levado a uma regulação negativa mediada pelo miR164c da síntese das proantocianidinas, uma via que compete diretamente pelo mesmo substrato com a via de síntese de antocianinas, ao ter induzido um decréscimo da expressão do gene VvLAR1 e da atividade bioquímica da enzima LAR, que resultou na diminuição da concentração total de proantocianidinas. Assim, a aplicação do miPEP-MYBPA1 consiste numa nova e promissora estratégia para modular vias do metabolismo secundário em células de bago de uva, com o intuito de aumentar a síntese e acumulação de antocianinas, ao tirar partido de mecanismos de regulação de plantas endógenos mediados por miRNAs.