Genotoxicity of propolis extracts from Beira Alta: insights on the mode of action, using different biological models

Abstract

Propolis is a natural mixture produced by honey bees (particularly Apis mellifera L.) from various plant sources. Characterized by a plethora of chemicals, propolis is generally rich in flavonoids, phenolic acids and derivatives and terpenes, associated to it’s antimicrobial, antioxidant and cytotoxic activities, among others. In a previous investigation, an ethanol extract of propolis from the Portuguese region of Beira Alta (Côa) was reported to exhibit unique dual genotoxic and antigenotoxic effects, but no mechanism of action (MOA) was identified. Despite the growing demand for propolis-based products by several industries, the national supply is limited and unstandardized, still not perceived as profitable by the beekeepers, so with the import of products being inevitable. For the present work, two ethanol extracts of propolis samples from Pereiro (P), collected in 2010 (P10) and 2017 (P17), were prepared to investigate the mechanisms of cytotoxicity, genotoxicity and phytotoxicity, using S. cerevisiae and Linum usitatissimum L. as models. While P17.EE did not show any toxic effect at the range of concentrations tested, yeast cells exposed to other Pereiro propolis extracts showed decreased viability along time. As the mutant yap1, deleted in an essential gene for oxidative stress response, was not affected or slightly more resistant than the wild type, the cytotoxic effect was not mediated by oxidative stress. With both extracts inducing the loss of plasma membrane integrity, the genotoxicity of propolis extracts was analyzed by the nucleus-to-cytosol translocation of Nhp6A protein, a necrotic marker, by fluorescence microscopy. Only P10.EE induced this translocation, suggesting that its cytotoxicity was mediated by necrosis. With the plant model it was observed that both propolis extracts induced a strong concentration-dependent inhibition in root and epicotyl growth, but less impact on hypocotyls, being P10 more inhibitory than P17. Also, effects on cell cycle of these cells/organs assessed by flow cytometry showed that P10, but not P17 at the same concentration (750 μg mL-1), have increased the population of root nuclei in G0/G1. Photosynthetic activity, assessed by 2D Pulse Amplitude Modulated fluorometry in flax cotyledons, was not affected by propolis extracts under growth light conditions, but P17 improved the rETR1000 and Fv/Fm recovery after a high-light challenge, suggesting a possible role in the mitigation of photooxidation. To our knowledge, here we present the first evidences that high concentrations of Pereiro propolis have necrotic-mediated cytotoxicity in yeast cells and cause impairments in the cell cycle on in vitro grown flax root cells, contributing to the elucidation of its MOA.

Própolis é uma resina natural produzida por abelhas (particularmente Apis mellifera L.) a partir de várias fontes vegetais. Constituído por dezenas de compostos, o própolis é geralmente rico em flavonóides, ácidos fenólicos e derivativos e terpenos, associados às suas atividades antimicrobianas, antioxidantes e citotóxicas, entre outras. Num estudo anterior observou-se que um extrato etanólico de própolis da região da Beira Alta (Côa, Portugal) exibiu efeitos genotóxicos e antigenotóxicos, mas o mecanismo de ação (MOA) não foi identificado. Apesar da crescente procura, por diversas indústrias, de produtos à base de própolis, a oferta nacional é limitada e não padronizada, não sendo a sua rentabilidade reconhecida pelos apicultores, sendo assim inevitável a importação destes produtos. Para o presente trabalho, dois extratos etanólicos de amostras de própolis de Pereiro (P), recolhidas em 2010 (P10) e 2017 (P17), foram preparados para investigar os mecanismos de citotoxicidade, genotoxicidade e fitotoxicidade, usando S. cerevisiae e Linum usitatissimum L. como modelos. Enquanto que o P17 não apresentou efeito tóxico na gama de concentrações testadas, as células de levedura expostas a outros extratos de própolis do Pereiro mostraram menor viabilidade ao longo do tempo. O mutante yap1, com supressão de um gene essencial para a resposta ao stresse oxidativo, não foi afetado ou foi ligeiramente mais resistente que a estirpe selvagem, concluindo-se que a citotoxicidade não foi mediada por stresse oxidativo. Com ambos os extratos de própolis a induzirem perda da integridade da membrana plasmática, a genotoxicidade foi analisada pela translocação nucleo-citosólica da proteína Nhp6A, um marcador necrótico, por microscopia de fluorescência. Apenas P10 induziu esta translocação, sugerindo que a sua citotoxicidade foi mediada por necrose. Com o modelo da planta observou-se que os ambos os extratos de própolis induziram uma forte inibição, dependente da concentração, do crescimento de raízes e epicótilos, sendo P10 mais inibitório que P17. Efeitos no ciclo celular destas células/orgãos avaliados por citometria de fluxo demonstraram que P10, mas não o P17 (ambos a 750 μg mL-1), aumentou a população de núcleos em G0/G1 da raiz. A atividade fotossintética, avaliada por fluorometria de Pulso de Amplitude Modulada em cotilédones de linho, não foi afetada pelos extratos sob condições de luz de crescimento, mas P17 melhorou a rETR1000 e a recuperação de Fv/Fm após tratamento a luz intensa, sugerindo um possível papel na mitigação da fotoxidação. Do nosso conhecimento, apresentamos aqui as primeiras observações de que elevadas concentrações de própolis do Pereiro apresentam citotoxicidade mediada por necrose em células de levedura e causam danos no ciclo celular em células de raiz de linho cultivadas in vitro, contribuindo para a elucidação do seu MOA.