Control of Salmonella Enteritidis biofilms present on different food contact surfaces using bacteriophages

Abstract

Salmonella, a human pathogenic bacterium, is still, nowadays, one of the main causes of food-related outbreaks, that result in thousands of illnesses and hospitalizations each year, around the globe. Contaminated poultry, fruit, and fresh vegetables are the key vehicles of human contamination, which could be prevented by the application of good processing practices and appropriate washing of food products. Besides this, the fact that Salmonella can form biofilms on food working surfaces and equipments, makes this microorganism even more difficult to eliminate with the commonly used chemical and physical cleaning procedures. Hence, the development of new Salmonella control strategies is imperative. Virulent bacterio(phages), viruses that exclusively infect bacteria, resulting in their lysis, are regarded as good alternatives for the elimination of Salmonella biofilms and adhered cells from contaminated surfaces and food products. Therefore, the main objective if this thesis was the application of phages for the control of S. Enteritidis biofilms formed on different food contact surfaces. In this work, a Salmonella phage, named PVP-SE2, was genomically analysed, and based on the nowadays gene information available in databases, this phage does not encode for known toxins or antibiotic resistance, making it a great candidate for the biocontrol of Salmonella. Other characterizations were also completed, such as determination of its growth parameters and phage infectivity towards S. Enteritidis biofilm communities after artificial contamination of surfaces (e.g. polystyrene, stainless steel, and poultry skins). Results showed that this phage was capable of reducing the number of Salmonella cells adhered to these surfaces, and also of significantly reducing the bacterial loads present in the formed biofilms. These results reaffirmed PVP-SE2 potential to be used in the control of this pathogen. Like most phage genomes, PVP-SE2 genome presented many open reading frames (ORFs) that encoded for proteins with unknown function. This comes as an obstacle since some of these ORFs may encode for proteins with toxic or other undesired properties. To be accepted in a possible phage-based product, the deletion of all of the ORFs with unknown and unnecessary functions would be ideal. Therefore, a strategy was designed: to use Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA to create a phage genome devoid of the ORFs with unknown and unnecessary functions. The first ORF with unknown function considered for deletion was Orf_01, which was successfully achieved. The stability of this mutation was evaluated, and the results showed that Orf_01 deletion was stable for at least 11 generations. The new recombinant phage, named PVP-SE2ΔOrf_01, was characterized regarding its replication parameters and ability to infect S. Enteritidis planktonic cells in the exponential and stationary phases. It was shown that, although PVP-SE2ΔOrf_01’s kinetics of infection were substatially different from the wild type phage, the reductions of Salmonella planktonic cells in both exponential and stationary phases were identical to the ones obtained for PVP-SE2, most likely due to the faster latent period of this phage compared to its parental phage. This work showed that BRED is a suitable method to genetically modify phages, and also that Orf_01 is not essential for PVP-SE2 replication and infection abilities. Escherichia coli, another human pathogen commonly related to foodborne outbreaks, was previously shown to be present together with Salmonella in food processing facilities. This information led to the idea that these two bacteria could be forming mixed biofilms when contaminating food working surfaces. Hence, the last chapter of this thesis was dedicated to the study of interactions found to happen between E. coli and S. Enteritidis when forming dual-species biofilms, and how this relationship could affect the ability of a cocktail composed by two phages, DaIca, an E. coli phage, and 135, a Salmonella phage, to control these mixed biofilm populations. First, kinetics formation of mono- and dual-species biofilms were characterized, showing that both bacteria grew more when alone than in mixed biofilms. Then, confocal laser microscopy imaging was used to characterize spatial distribution of both species when forming single and mixed biofilms, which showed that spatial distribution of cells in dual-species biofilms resembles the distribution of E. coli and S. Enteritidis, when in single biofilms. FTIR-ATR biofilm extracellular polymeric substances (EPS) matrices analyses were performed and showed that the EPS spectra of mixed species biofilms can either be a mixture of both species EPS, or that the EPS of one strains predominates. DaICa and 135 phages were used to challenge both mono- and dual-species biofilms, and results showed that both phages had a better antibiofilm capacity against E. coli and S. Enteritidis, respectively, when these species formed single-species biofilms, rather than mixed biofilms. This could be explained by the alterations in biofilm structure, EPS composition when the two species are forming a mixed biofilm, by the differences in phage growth characteristics in the two strains of each species tested, and also the distinct growth characteristics of the strains used in this work. In conclusion, this work has emphasized the importance of the control of S. Enteritidis biofilms using phages as an alternative to the usually used cleaning processes so cross-contamination of food products does not occur. However, it has been shown that, although phages can effectively reduce the number of viable cells present on different types of food contact surfaces, this is not enough. Therefore, the need to genetically modify phages so that they become more effective towards biofilms, which can be accomplished by the insertion, for example, of genes encoding for enzymes with antibiofilm properties, or genome engineered phages that contain only essential genes for their replication and infectivity, so they become safer to be used in a possible phage-based product, is a reality and it should be pursued. Furthermore, since biofilms in nature are rarely composed just by one bacterial species, more studies of species-species interactions that can influence phage’s antibiofilm properties must be done in a more exhaustive manner.

Salmonella, uma bactéria patogénica para os humanos, continua a ser, nos dias de hoje, uma das principais causadoras de surtos relacionados com alimentos, que resultam em milhares de pessoas doentes e até mortes, por ano, em todo o mundo. Carne de aves, fruta e vegetais frescos são os principais veículos de contaminação de humanos, o que poderia ser evitado pela aplicação de boas práticas de processamento e de lavagem dos alimentos. Para além disso, o facto de Salmonella ter a capacidade de formar biofilmes em superfícies e equipamentos de processamento de alimentos, torna este microrganismo ainda mais difícil de eliminar com os procedimentos químicos e físicos normalmente usados na limpeza. Por isso, é imperativo o desenvolvimento de estratégias alternativas de controlo de Salmonella. Os (bacterió)fagos, vírus que infetam exclusivamente bactérias, são vistos como boas alternativas para a eliminação de biofilmes e células aderidas de Salmonella presentes em superfícies e alimentos contaminados. Deste modo, o principal objetivo do trabalho desenvolvido nesta tese foi a aplicação de fagos para o controlo de biofilmes de Salmonella Enteritidis formados em diferentes superfícies que periodicamente se encontram em contacto com alimentos. No presente trabalho, o genoma do fago PVP-SE2, específico para S. Enteritidis, foi analisado, e os resultados obtidos demonstraram que não codifica para genes de toxinas nem genes de resistência a antibióticos conhecidos, tornando este fago um ótimo candidato para o biocontrolo deste agente patogénico. De seguida, os parâmetros de replicação do fago PVP-SE2 foram caracterizados para avaliar e confirmar a sua capacidade de infetar e replicar em células de S. Enteritidis, o microrganismo modelo usado neste estudo. Posteriormente, diferentes superfícies, como o polistireno, aço inoxidável, e pele de galinha, foram artificialmente contaminados com S. Enteritidis, durante várias horas, e tratadas com o fago PVP-SE2. Os resultados desta experiência mostraram que este fago foi capaz de reduzir o número de células de S. Enteritidis aderidas às superfícies descritas, e também de reduzir significativamente os níveis de bactérias presentes nos biofilmes formados. Estes resultados reafirmam o potencial do fago PVP-SE2 para ser usado no controlo de Salmonella. Como a maioria dos genomas de fagos, o genoma do PVP-SE2 é constituído por várias open reading frames (ORFs) que codificam para proteínas de função desconhecida. Esta característica surge como um obstáculo porque algumas destas ORFs podem codificar para proteínas com propriedades tóxicas ou outras propriedades indesejadas. Para que seja aceite para um possível produto à base de fagos, a deleção de todas as ORFs com funções desconhecidas e desnecessárias à replicação do fago no seu hospedeiro seria a uma hipótese a ter em conta. Por isso, uma estratégia foi definida: usar a técnica de Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA para criar um genoma livre de ORFs com funções desconhecidas e desnecessárias. A primeira ORF com função desconhecida que foi considerada para deleção foi a Orf_01, tarefa que foi concluída com sucesso. A estabilidade desta mutação foi avaliada e os resultados obtidos mostraram que a deleção da Orf_01 mantave-se estável durante pelo menos 11 gerações. O novo fago recombinante, nomeado PVP-SE2ΔOrf_01, foi caracterizado tendo em conta os seus parâmetros de replicação e a sua capacidade de infeção de células planctónicas de S. Enteritidis nas fases exponencial e estacionária. Neste trabalho, foi demonstrado que, apesar de o fago PVP-SE2ΔOrf_01 apresentar uma cinética de infeção bastante diferente daquela apresentada pelo fago selvagem, as reduções de células de Salmonella nas fases exponencial e estacionária foram idênticas às obtidas com o fago PVP-SE2. Este estudo mostra que a técnica de Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA é adequada à modificação genética de fagos, e simultaneamente que a Orf_01 não é essencial à replicação e capacidade de infeção do fago PVP-SE2. Escherichia coli, outra bactéria patogénica para os humanos comummente relacionada com surtos de origem alimentar, foi já previamente isolada juntamente com Salmonella em instalações de processamento de alimentos. Esta informação levou à dedução de que estas duas espécies bacterianas poderiam formar biofilmes mistos em superfícies de processamento alimentar. Assim, o último capítulo desta tese foi dedicado ao estudo das interações que surgem entre E. coli e S. Enteritidis quando estas formam biofilmes mistos, e como esta relação poderia afetar a capacidade de um cocktail fágico, composto pelos fagos DaIca, de E. coli, e 135, de S. Enteritidis, de controlar estes biofilmes. Primeiramente, as cinéticas de formação dos biofilmes simples e mistos foram caracterizadas, mostrando que ambas as espécies crescem melhor em biofilmes simples do que em mistos. De seguida, a tecnologia de microscopia confocal a laser foi utilizada para caracterizar a distribuição espacial de ambas as espécies ao formarem biofilmes simples e mistos, o que revelou que a distribuição das células em biofilmes mistos se assemelha à distribuição de E. coli e S. Enteritidis em biofilmes simples. A técnica de espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier com refletância total atenuada foi usada para analisar as matrizes de substâncias poliméricas extracelulares dos biofilmes estudados, revelando que os espectros destas em biofilmes mistos podem ser, por um lado, uma mistura de substâncias poliméricas extracelulares de ambas as espécies, ou por outro, que as substâncias poliméricas extracelulares de uma espécie são predominantes. Os fagos DaIca e 135 foram aplicados em biofilmes simples e mistos, sendo que os resultados obtidos mostraram que ambos os fagos apresentam uma capacidade anti-biofilme mais elevada contra E. coli e S. Enteritidis, respetivamente, quando estas se encontram em biofilmes simples do que quando se apresentam em biofilmes mistos. Estes resultados podem ser explicados pelas alterações sofridas na estrutura dos biofilmes e composição das suas substâncias poliméricas extracelulares quando as duas espécies estão presentes num biofilme misto. Em conclusão, esta tese enfatiza a importância do controlo de biofilmes de S. Enteritidis usando fagos como alternativa aos usuais procedimentos de limpeza de forma a que a contaminação cruzada de alimentos não ocorra. Contudo, ficou demostrado que, apesar de os fagos terem a capacidade de reduzirem o número de células viáveis presentes em diferentes tipos de superfícies que se encontram em contacto com produtos alimentares, esta redução não é suficiente. Desta forma, a necessidade de adotar novas estratégias de controlo de biofilmes de Salmonella, como o uso de fagos geneticamente modificados com capacidade aumentada de diminuir o número de células bacterianas presentes nos biofilmes, pela inserção, por exemplo, de genes que codifiquem para enzimas com ação contra os biofilmes, ou desenvolver fagos geneticamente modificados para conter apenas genes essenciais para a sua replicação e capacidade de infeção, de modo a que se tornem mais seguros para serem usados num possível produto baseado em fagos, é uma realidade e deve ser tida em conta. Para além disso, uma vez que, na natureza, os biofilmes são raramente constituídos por uma única espécie bacteriana, estudos mais aprofundados das interações espécie-espécie que podem influenciar as propriedades anti-biofilme dos fagos devem ser levados a cabo.