Tuning of Pseudomonas sp. M1 towards β-myrcene catabolism

Abstract

All the living systems suffers evolution during theirs lifespan. Evolution allows the development of beneficial traits able to increase the growth and reproduction of the population in a specific environment. New traits can be achieved through mutations in the genome. The fixation of mutations able to increase the growth and reproduction of the population is achieved through the passage of such mutation to the next generations, being this phenomena called natural selection. This principle can be applied in laboratory allowing the improvement of traits present in microorganisms interesting from an industrial point of view. Evolution of a strain may allow the production and accumulation of high-valued compounds, through the metabolism of recalcitrant carbon sources, whose production through chemical synthesis shows some throwbacks. During this thesis Pseudomonas sp. M1 was grown theoretically during an estimated time of 500 generations in Minimal Medium using Lactate or β-myrcene as the only available carbon sources. These carbon sources were chosen according to previous works from the investigation team, being the main focus the β-myrcene. This compound is a hydrophobic terpene that allows the production of terpenoids, compounds industrially valued, during its metabolic pathway. Within other projects developed by the investigation team, the final purpose of this work is the development of a biocatalyst based in Pseudomonas sp. M1, able to transform and accumulate terpenoids using β-myrcene as carbon source. Regarding the ongoing research, 3 colonies were isolated with possible improvement of β-myrcene transformation in comparison to the ancestor strain. To understand the evolution occurred in both conditions, the genome of the population was isolated and sequenced in 2 different time points, allowing the identification of 2 types of mutations, SNVs and Indels, in comparison to the ancestor. In lactate cultures, mutations in mutL and mutS genes were detected, being the mutation rate around one order of magnitude higher in comparison to the β-myrcene cultures. The number of mutations detected for β- myrcene cultures did not allow to conclude about the adaptation occurred in these cultures. In the future, this experiment should be continued, being also necessary the sequencing of isolated lineages and the characterization of the lineages already identified with a possible increase in β- myrcene catabolism.

Todos os sistemas vivos passam por processos de evolução. Estes processos poderão permitir a adaptação a novos ambientes, através de ajustes evolutivos a nível molecular e fisiológico, podendo ser alcançado através de mutações no genoma. A fixação de mutações benéficas, mutações capazes de beneficiar o crescimento e reprodução da população no ambiente em que estão inseridas, é alcançada através da sua passagem para as gerações futuras. Este é o princípio da seleção natural. Este princípio pode ser aplicado em laboratório de modo a melhorar características presentes nos microrganismos que são interessantes do ponto de vista biotecnológico. A evolução ocorrida em determinada estirpe pode levar a uma produção rentável e acumulação de compostos valorizados, cuja produção através de síntese química mostra diversas complicações. Durante esta tese, Pseudomonas sp. M1 foi crescida em Meio Mínimo contendo Lactato ou β- mirceno como únicas fontes de carbono disponíveis. As fontes de carbono utilizadas estão de acordo com trabalhos anteriores da equipa de investigação, sendo o principal foco o β-myrceno. Este composto é um terpeno hidrofóbico, cujo metabolismo leva à produção de terpenóides, compostos valorizados industrialmente. O objetivo é o desenvolvimento de um biocatalisador capaz de transformar e acumular terpenoides utilizando β-mirceno como fonte de carbono e utilizando Pseudomonas sp. M1 para este propósito. No âmbito da investigação em curso, foram isoladas 3 linhagens com possível aumento na eficiência de transformação do β-mirceno, indicando a possível adaptação das culturas evoluídas. De modo a perceber a evolução ocorrida em ambas as condições, foi isolado e sequenciado o genoma da população em 2 tempos diferentes, permitindo a identificação de 2 tipos de mutações (SNVs e Indels) em relação à estirpe ancestral, sendo que o número de mutações detetadas variou consideravelmente entre as duas fontes de carbono utilizadas. Nas culturas de lactato foram detetados variantes nos genes mutL e mutS, apresentando um rácio de mutações cerca de uma ordem de grandeza superior às culturas de β-mirceno. O número de mutações detetadas em β-mirceno não permitiu concluir sobre a adaptação ocorrida nestas culturas. Futuramente a experiência deverá ser continuada e deverá proceder-se à sequenciação de linhagens isoladas e à caracterização das linhagens detetadas com um possível aumento na capacidade de catabolizar β-mirceno.