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https://hdl.handle.net/1822/55826
Título: | Analysis of human copper transporters in yeast |
Autor(es): | Figueiredo, Ana Beatriz Lacerda da Silva e |
Orientador(es): | Paiva, Sandra |
Palavras-chave: | Copper Copper transporters Saccharomyces cerevisiae Ctr1 Ctr2 Cobre Transportadores de cobre Saccharomyces cerevisiae |
Data: | 2018 |
Resumo(s): | Copper is a trace element essential for cell survival, being required for respiration, neuronal myelination, angiogenesis, and many other processes. However, at high concentrations, copper is extremely toxic for cells, hence copper homeostasis is regulated by highly conserved mechanisms. Those mechanisms involve the posttranscriptional regulation of copper transporters (Ctrs), both in human and in yeast cells. It has already been demonstrated that one of the mechanisms that regulates copper is the endocytosis of Ctrs, followed by vacuolar degradation. Nevertheless, the biochemical processes that control downregulation of copper transporters, especially endocytic trafficking, remain to be elucidated. Recent studies on the chemotherapeutic cisplatin highlighted the relevance of the expression of the copper transporters Ctr1 and Ctr2 for the success of the treatment, since the copper ion and the chemotherapeutic agent present structural similarity. The study of transporters in mammalian cells is a challenge considering its economic cost and the complexity of human cells metabolism. In this project, we followed a simpler approach to study this type of proteins. Codon-optimized synthetic human CTR1 and CTR2 genes were used for heterologous protein expression in Saccharomyces cerevisiae strains, disrupted in their native copper transporter genes. In order to evaluate the expression of the human transporters, growth assays were performed revealing the phenotypic complementation of human Ctr1 in mutant yeast strains. The intracellular localization and expression of the transporters was followed by fluorescence microscopy. The results obtained indicated that the human transporters were successfully expressed in yeast cells. O cobre é um oligoelemento essencial para a sobrevivência das células e é necessário para a respiração, mielinização neuronal, angiogénese e muitos outros processos. No entanto, em altas concentrações, o cobre é extremamente tóxico para as células, portanto a homeostase do cobre é regulada por mecanismos altamente conservados. Estes mecanismos envolvem a regulação pós-transcricional de transportadores de cobre (Ctrs) em células humanas e em células de levedura. Já foi demonstrado que um dos mecanismos que regulam o cobre é a endocitose dos Ctrs seguida da sua degradação vacuolar. No entanto, os processos bioquímicos que controlam a regulação negativa de transportadores de cobre, especialmente os responsáveis pelo fluxo endocítico, ainda precisam de ser elucidados. Estudos recentes sobre o agente quimeoterapêutico cisplatina, têm demonstrado a relevância da expressão dos transportadores Ctr1 e Ctr2 para o sucesso do tratamento, uma vez que o ião de cobre e o agente quimioterapêutico apresentam alguma similaridade estrutural. O estudo de transportadores em células de mamíferos é um desafio devido ao seu custo económico e à complexidade do metabolismo das células humanas. Neste projeto seguimos uma abordagem mais simples para o estudo deste tipo de proteínas. Os genes CTR1 e CTR2 sintéticos de humano, com codões otimizados, foram utilizados para a expressão das proteínas heterólogas em estirpes de Saccharomyces cerevisiae, interrompidas nos seus genes nativos de transportadores de cobre. Para avaliar a expressão dos transportadores, ensaios de crescimento em placa foram realizados, tendo sido observada complementação fenotípica de Ctr1 de humano, em estirpes de levedura mutantes. A localização intracelular e expressão dos transportadores foi avaliada por microscopia de fluorescência. Os resultados obtidos indicam que os transportadores humanos foram expressos com sucesso em células de levedura. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Genética Molecular |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/55826 |
Acesso: | Acesso restrito UMinho |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
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Thesis_ABF.pdf Acesso restrito! | 1,76 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |