Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/54779

TitleDeciphering the role of exposed surface residues in protein stability
Author(s)Pacheco, Ana Margarida Ribeiro
Advisor(s)Collins, Tony
KeywordsEnzymes
Biocatalysts
Cold-adapted xylanase
Protein precipitation
Acidic stability
Protein engineering
Mutagenesis
Enzimas
Catalisadores biológicos
Xilanase adaptada ao frio
Precipitação de proteínas
Estabilidade em meios acídicos
Engenharia de proteínas
Mutagénese
Issue date2017
Abstract(s)Enzymes are macromolecular biological catalysts which accelerate the rate of chemical reactions in the cells of living organisms. They are essential for life but are now also an essential element of industry where their utilisation as biocatalysts is already valued at 5 billion Euros. Their use has enabled for novel improved products, and more sustainable, cleaner process alternatives for the chemical, food, pharmaceutical and agricultural industries. The research group of the present proposal have previously isolated and extensively characterised a novel highly active cold-adapted xylanase enzyme and while this has been successfully commercialised worldwide for use in baking applications, a reduced activity and stability at acidic pHs precludes its further valorisation. Studies have indicated precipitation as the predominating factor leading to the observed reduced acidic pH performance of this enzyme. Indeed precipitation is a common problem with many proteins, and understanding the determinants of this would advance our knowledge of design principles and concepts for engineering proteins to overcome it. The objective of the present study was to gain a better understanding of the molecular determinants of precipitation in proteins at low pHs, using the cold-adapted xylanase as the model enzyme. A series of bioinformatics, molecular biology and biochemical tools were used to identify target residues for mutation, introduce the desired mutations, and produce, purify and characterise the wild type and mutant enzymes. Both a manual bioinformatics approach based on identifying suitable exposed hydrophobic and acidic residues, and an automatic approach using the online software CamSol design were used for target amino acid identification. A total of 32 target amino acids were identified and as part of a larger study being carried out in the host laboratory we focused on 7 mutations. All were mutated to the highly polar residue serine. A number of mutants were found to display a reduced activity and even a reduced stability as compared to the wild type enzyme. Nevertheless, 2 of the mutants (D38S and E165S) displayed a slight shift in the pH maximum for activity towards low pHs yet none displayed an enhanced solubility. Combination of the results of this study with those from ongoing studies investigating the remaining targets identified should allow for a better understanding of the determinant of precipitation in this xylanase.
Enzimas são catalisadores biológicos macromoleculares que aceleram as reações químicas celulares dos organismos vivos. Estas são essenciais à vida e desempenham também um papel fundamental na indústria, onde a sua utilização como catalisador biológico é já avaliada em 5 biliões de euros. A sua utilização tem permitido a criação de produtos inovadores e processos alternativos mais sustentáveis e ecológicos para as indústrias químicas, alimentares, farmacêuticas e agrícolas. O grupo de investigação onde foi realizado o presente trabalho isolou e caracterizou, em trabalhos anteriores, uma nova xilanase adaptada a ambientes frios altamente ativa, e apesar de esta já ser comercializada globalmente para aplicações na indústria da panificação, a sua reduzida atividade e estabilidade em ambientes acídicos impossibilita uma maior valorização. Estudos prévios apontaram a precipitação como sendo o fator principal responsável pelo baixo desempenho desta enzima a pHs ácidos. De facto, a precipitação é um problema comum a muitas proteínas, e perceber os fatores que desencadeiam este fenómeno vai levar ao progresso na conceção de princípios e conceitos na área da engenharia de proteínas para ultrapassar este problema. O objetivo do presente estudo foi perceber melhor os fatores moleculares envolvidos na precipitação de proteínas a pHs baixos, usando a xilanase adaptada ao frio como enzima modelo. Vários recursos bioinformáticos, de biologia molecular e bioquímicos foram usados para identificar os resíduos alvo para mutar, introduzir a mutação pretendida e produzir, purificar e caracterizar a enzima wild type e os mutantes. Tanto uma abordagem bioinformática manual, baseada na identificação dos resíduos expostos hidrofóbicos e acídicos mais adequados, como uma automática usando o software CamSol design foram usadas para identificação dos aminoácidos alvo. Um total de 32 aminoácidos foram identificados e, como parte de um estudo extenso que está a decorrer no nosso laboratório, este trabalho foca-se em 7 mutantes. Todos os resíduos foram mutados pelo aminoácido com grande polaridade, serina. Vários mutantes demonstraram uma menor atividade e mesmo menor estabilidade comparativamente ao wild type. No entanto, 2 dos mutantes (D38S e E165S) demonstraram um ligeiro desvio do máximo de atividade para valores de pH mais baixos, contudo, nenhum demonstrou ter uma solubilidade melhorada. A junção dos resultados deste estudo com os que estão a ser levados a cabo de momento no laboratório com os restantes aminoácidos identificados deverá permitir uma melhor compreensão dos fatores determinantes na precipitação desta enzima.
TypeMaster thesis
DescriptionDissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (área de especialização em Biomedicina)
URIhttp://hdl.handle.net/1822/54779
AccessRestricted access (UMinho)
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
CCT - Dissertações de Mestrado/MSc Dissertations
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses

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