Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/50060

TitleInternalization of resveratrol nanoparticles in yeast and bioactivity
Other titlesInternalização e bioatividade do resveratrol em nanopartículas em células de levedura
Author(s)Barbosa, Célia de Jesus Sousa
Advisor(s)Gerós, H.
Real Oliveira, M. Elisabete C.D.
Issue date2017
Abstract(s)Resveratrol (RSV) is a phenolic compound, belonging to a class of chemical compounds derived from phenylalanine with a reactive hydroxyl group (-OH) attached to an aromatic hydrocarbon ring. Several pharmacological effects were attributed to RSV, including antioxidant properties. Different studies have also shown that RSV has a very low bioavailability, which has led to the suspicion that many of the observed health benefits may not be attainable in humans due to its rapid metabolism. To improve bioavailability and pharmacokinetic profile some attempts have been made to encapsulate RSV into a lipid based nanocarrier system, such as liposomes, which are clinically established for drug delivery. The therapeutic efficiency of liposomes systems is highly dependent on the characteristics of lipid molecules, which influence the structure and stability of this type of nanocarriers under physiological conditions. Previous work by our group has shown that liposomes prepared with DODAB:MO (1:2) are promising nanocarriers for delivery of nucleic acids and proteins. Also, these nanocarriers were exploited to load with RSV and important parameters critical for their efficient biological application were assessed. In the scope of the previous research work developed by Inês Ferreira (Master thesis in Biophysics and Bionanosystems, University of Minho, 2015) the DODAB:MO (1:2) liposomal system loaded with RSV revealed adequate characteristics for drug release purposes, high stability and homogeneity, high positive surface charge, and a good as well as a good encapsulation efficiency i.e. the percentage of RSV which is incorporated by liposomal system, (EE%), and the percentage of RSV which is incorporated by total lipid concentration (RL%). In the context of the present study the yeast Saccharomyces cerevisiae W303-1A was then used as a cell model to evaluate the biological activity of RSV loaded DODAB:MO (1:2) liposomes. Internalization studies of RSV-loaded liposomes were then performed using fluorescent probes and fluorescence microscopy, and their biological activity was compared with free RSV using ROS-sensitive probes coupled to flow cytometry analysis. After 5 h incubation yeast cells readily internalized liposomes, that appeared as bright blue spots in the periphery of the central vacuole. Moreover, when yeast cells were incubated with DPH alone no fluorescence was detected in the cytosol. When yeast cells were incubated with the lipophilic fluorescent probe FM1-43, results showed that its green fluorescence co-localized with the blue fluorescence of DPH, suggesting that liposomes are efficiently internalized by cells and follow the endocytic pathway. To study the effect of RSV in yeast mitochondrial morphology, the strain S. cerevisiae W303-1A Pyx232-mtGFP, which expresses a mitochondrial matrix-targeted GFP was used. Results showed that cells displaying non-fragmented/tubular mitochondrial networks predominate up to 5 h mostly in control conditions, while a the vacuolar/diffuse cytosolic fluorescence predominate after 40 h of incubation either with free or encapsulated RSV. Moreover, the incubation with liposomes containing 200 μM RSV during 45 h was the experimental condition where cells exhibiting the latter phenotype were more abundant.
O resveratrol (RSV) é um composto fenólico, pertencente a uma classe de compostos químicos derivados de fenilalanina com um grupo hidroxilo reativo (-OH) ligado a um anel de hidrocarboneto aromático. Vários efeitos farmacológicos têm sido atribuídos a este composto, incluindo propriedades antioxidantes. Vários outros estudos demonstraram que o RSV tem uma biodisponibilidade muito baixa, o que levou a suspeitar que muitos dos potenciais efeitos benéficos para a saúde, poderiam não ser atingíveis em seres humanos devido ao seu rápido metabolismo. Como forma de melhorar a biodisponibilidade e o perfil farmacocinético, foram executadas várias tentativas para encapsular RSV em lipossomas, nanossistemas clinicamente estabelecidos para a administração de fármacos. As eficiências terapêuticas dos lipossomas são dependentes das características das moléculas lipídicas, que influenciam a sua estrutura e a estabilidade em condições fisiológicas. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que os lipossomas preparados com o DODAB:MO, são nanossistemas promissores para transporte de ácidos nucleicos e proteínas. No âmbito do trabalho desenvolvido por Inês Ferreira (Tese de Mestrado em Biofísica e Bionanossistemas, Universidade do Minho, 2015), o sistema lipossomal DODAB:MO carregado com RSV, revelou-se com características adequadas para a libertação controlada do RSV, mostrando estabilidade e homogeneidade, carga superficial positiva, bem como uma boa eficiência de encapsulação isto é a percentagem de RSV que é incorporado no sistema lipossomal (EE%) e a percentagem de RSV incorporada relativamente à concentração total de lípido (RL%). No presente estudo, para avaliar a atividade biológica dos nanossistemas foi usada a levedura Saccharomyces cerevisiae W303-1A como modelo celular. Para os estudos de internalização dos lipossomas carregados com RSV foram realizados ensaios de microscopia de fluorescência e de citometria de fluxo com sondas fluorescentes apropriadas, e a sua atividade biológica foi comparada com a do RSV livre. Após 5 h de incubação as células de levedura internalizaram eficazmente os lipossomas, que se localizam na periferia do vacúolo central como esferas azuis brilhantes. Quando as células de levedura foram incubadas com a sonda lipofílica fluorescente FM1-43, a fluorescência verde colocalizou com a fluorescência azul do DPH, sugerindo que os lipossomas são internalizados eficientemente pelas células e seguem a via endocítica. Para estudar o efeito do RSV na morfologia mitocondrial de levedura, utilizou-se a estirpe S. cerevisiae W303-1A Pyx232-mtGFP a expressar uma GFP na matriz mitocondrial. Nos tempos iniciais de incubação predominaram células com redes mitocondriais nãofragmentadas/ tubulares, principalmente nas condições controlo, enquanto quer na presença de RSV livre ou encapsulado durante 40 h, células com fluorescência citosólica/vacuolar difusa eram muito abundantes.
TypeMaster thesis
DescriptionDissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas
URIhttp://hdl.handle.net/1822/50060
AccessEmbargoed access (3 Years)
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
CDF - FAMO - Dissertações de Mestrado/Master Thesis
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses

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