Understanding the role of oncogenic KRAS mutations in the regulation of mitochondria metabolism and BAX-mediated cell death

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide and KRAS mutations (KRASm), namely the hotspot mutations KRASG12D, KRASG12V or KRASG13D, are considered the most frequent gain-of-function mutations, affecting approximately 30-50% of patients with CRC. RAS family proteins can have ambiguous effects on autophagy and apoptosis, regulating several downstream effectors. Our recent studies showed that KRASm induce autophagy both in yeast and “normal” colon cells and promote CRC cells survival during starvation. The apoptotic process is regulated by several proteins, having the Bcl-2 family member BAX a fundamental pro-apoptotic role in its mediation. This protein is translocated from the cytosol to the mitochondrial outer membrane in response to apoptotic stimuli. Here, we questioned the role of mutated human KRAS in autophagy/apoptosis regulation and how it interacts with mitochondria and mitochondrial proteins related to apoptosis such as BAX. For that propose we used KRAS-humanized yeast, a model already established in our laboratory to study KRASm. KRAS-humanized yeasts expressing KRASWT or the activating mutant forms KRASG12D, KRASG12V or KRASG13D, and co-transformed with the eGFP-RBD3 KRAS probe were used to access KRAS subcellular distribution by fluorescence microscopy, under different physiological conditions. KRAS isoforms presented a different intracellular distribution, KRASG12D and KRASG12V were more specifically located at the plasma membrane and KRASWT and KRASG13D were observed both in vacuole and plasma membrane. The KRAS-expressing yeast strains were also co-transformed with two isoforms of the human BAX, BAXWT and BAXP168A, to assess the potential influence of KRAS on BAX activity. We found that the intracellular distribution of the different KRAS isoforms is affected by BAX. Furthermore, KRASm partially reverted the role of BAX, leading to a protection against BAX-mediated cell death. Altogether the results suggest that KRAS may interact with BAX, promoting cell survival through modulation of its activity.

O cancro colorretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais comum em todo o mundo e as mutações do KRAS (KRASm), nomeadamente as mutações hotspot KRASG12D, KRASG12V ou KRASG13D, são as mutações de ganho de função mais frequentes, afetando cerca de 30-50% dos pacientes com CCR. As proteínas da família RAS podem desempenhar papéis ambíguos na autofagia e na apoptose, regulando vários vias a jusante. Os nossos estudos recentes mostraram que KRASm induzem autofagia tanto em levedura como em células “normais” do cólon e promovem a sobrevivência das células de CCR durante a privação de nutrientes. O processo apoptótico é regulado por várias proteínas, entre as quais BAX, um membro da família Bcl-2 que tem um papel pro-apoptótico fundamental. Esta proteína move-se do citosol para membrana externa da mitocôndria em resposta a um estímulo apoptótico. Na presente tese, questionámos o papel do KRAS humano mutado na regulação da autofagia/apoptose e na interação com a mitocôndria e com proteínas mitocondriais relacionadas com a apoptose, tal como BAX. Para isso, usámos a levedura a expressar diferentes isoformas do KRAS humano, um modelo já estabelecido no nosso laboratório. As leveduras que expressam KRASWT ou as formas mutantes ativadoras, KRASG12D, KRASG12V ou KRASG13D e co-transformadas com a sonda eGFP-RBD3 KRAS foram usadas para avaliar a distribuição subcelular de KRAS por microscopia de fluorescência, em condições fisiológicas diferentes. As isoformas de KRAS apresentaram diferentes distribuições intracelulares, KRASG12D e KRASG12V encontravam-se mais especificamente na membrana plasmática, enquanto que KRASWT e KRASG13D foram observados tanto no vacúolo como na membrana plasmática. As estirpes de levedura que expressam KRAS foram também co-transformadas com duas isoformas da proteína BAX humana, BAXWT e BAXP168A, para avaliar a potencial influência do KRAS na atividade de BAX. Mostrámos que a distribuição intracelular das diferentes isoformas de KRAS é afetada pela presença de BAX. Além disso, KRASm reverteram parcialmente o papel de BAX, levando à proteção contra a morte celular mediada por esta proteína. De modo geral, os resultados sugerem que KRAS pode interagir com BAX, promovendo a sobrevivência celular através da modulação da sua atividade.