Functional characterization of VvCAX3: a grapevine cation/H+ exchanger

Abstract

Several organic and mineral compounds including Ca2+ account for grape berry organoleptic and structural properties, ultimately translated into fruit quality. Besides its central role in cell signaling, Ca2+ has an essential function in the cell wall, greatly determining fruit integrity. Previous studies in tomato have demonstrated a close relationship between increased Ca2+ levels, increased fruit integrity and increased activity of CAX-type cation/H+ exchangers. Therefore, the identification and characterization of grapevine CAX transporters is a landmark towards understanding Ca2+ dynamics in the grape berry. In this study we have identified and functionally characterized the Vitis vinifera VvCAX3. Heterologous expression in a yeast strain deficient in Ca2+ detoxification showed that VvsCAX3 lacking the CAX autoinhibitory domain restored the ability of the strain to grow in high levels of Ca2+ (100-200 mM), validating its role in Ca2+ transport. In addition, results showed that VvsCAX3 may transport other cations, namely Na+, Li+, Mn2+ and Cu2+. Localization experiments following transformation with RFP and GFP fusion proteins showed that VvCAX3 is located in internal membranes both in yeast and plant cells, and in silico predictions further suggested that VvCAX3 is targeted to the vacuole membrane. Gene expression studies in grape cell suspensions (Cabernet Sauvignon Berry and Gamay Fréaux Teinturier) showed a regulation of transcript abundance by Ca2+ levels in the culture medium. Gene expression studies in grape cell suspensions (Cabernet Sauvignon Berry and Gamay Fréaux Teinturier) showed that Ca2+ levels regulated the transcript abundance of VvCAX3. VvCAX3 was also upregulated by Na+, further supporting its involvement in the homeostasis of other cations in grapevine. Also, the observed upregulation of VvCAX3 by methyl jasmonate, and the presence of cis-acting elements in VvCAX3 promotor related to several developmental and stress response processes, suggest other roles of VvCAX3 in grape berry physiology. Studies in planta demonstrated that VvCAX3 expression peaks in green berries (pea size), in accordance to the pattern of calcium accumulation during fruit development. VvCAX3 transcripts were also detected in grapevine roots, stems and leaves. Altogether, the present study provided important information on the role of VvCAX3 in the homeostasis of Ca2+ and other cations in grapevine.

Diversos compostos orgânicos e minerais, incluindo o Ca2+, contribuem para as propriedades organoléticas e estruturais dos bagos de uva, com implicações importantes na qualidade do fruto. Para além do seu papel central como sinalizador celular, o Ca2+ exerce uma função essencial na parede celular, determinando a integridade do fruto. Estudos anteriores em tomate demonstraram uma relação forte entre o aumento dos níveis de Ca2+, o aumento da integridade do fruto e o aumento da atividade dos transportadores CAX do tipo antiporte catião/H+. Portanto, a identificação e caracterização dos transportadores CAX da videira afigura-se importante do ponto de vista científico para a compreensão da dinâmica do Ca2+ nos tecidos do bago de uva. No presente trabalho, procedemos à identificação e caracterização funcional do VvCAX3 de Vitis vinifera. Experiências de expressão heteróloga recorrendo a uma estirpe mutante de levedura incapaz de destoxificar Ca2+ mostraram que o VvsCAX3 desprovido do domínio auto-inibitório restaurou a capacidade da levedura crescer na presença de níveis elevados de Ca2+ (100-200 mM). Estes resultados validaram o papel da proteína VvsCAX3 no transporte de Ca2+. Os resultados mostraram ainda que VvsCAX3 permeia outros catiões, como o Na+, o Li+, o Mn2+ e o Cu2+. Experiências de localização sub-celular recorrendo à transformação de células de levedura e de células vegetais com proteínas de fusão de VvCAX3 e VvsCAX3 com as proteínas fluorescentes RFP e GFP mostraram que VvCAX3 se localiza nas membranas intracelulares, e estudos in silico sugeriram que VvCAX3 reside na membrana vacuolar. Estudos de expressão do gene VvCAX3 em suspensões celulares de bagos de uva das castas Cabernet Sauvignon (células CSB) e Gamay Fréaux Teinturier mostraram que os níveis Ca2+ no meio de cultura regulam a abundância dos transcritos. O gene VvCAX3 foi também sobre-expresso na presença de 100 mM de Na+, confirmando o envolvimento do transportador na homeostasia de outros catiões na videira, para além do Ca2+. Adicionalmente, a observação que a eliciação com o metil jasmonato promoveu a sobre-expressão do gene VvCAX3 – cujo promotor possui elementos de regulação cis relacionados com vários processos de desenvolvimento e de resposta ao stresse, sugere que a proteína VvCAX3 tem outros papéis na fisiologia da videira. Estudos in planta demonstraram que a quantidade de transcritos do gene VvCAX3 atinge um pico no bago verde (fase de bago de ervilha) que coincide com o padrão de acumulação de cálcio durante o desenvolvimento do fruto. Os transcritos do gene VvCAX3 foram ainda detetados em raízes, caules e folhas de videira. No seu conjunto, o presente estudo forneceu informação importante sobre o papel da proteína VvCAX3 na homeostasia do Ca2+ e de outros catiões na videira.