Researching novel proteins involved with aneuploidy

Abstract

Aneuploidy is considered the most common genetic defect in humans. The abnormal chromosome number is the leading cause of miscarriages and in the survival cases leads to mental retardation and developmental abnormalities. As leading cause of aneuploidy it has been described errors in chromosome segregation during mitosis which comprises spindle assembly checkpoint (SAC) defects, merotelic attachments, centrosomal abnormalities and chromosome cohesion defects. This condition has also been associated with the development of many cancers such that it is considered a hallmark of cancer. In addition to be present in the majority of solid tumors there are some evidences that aneuploidy is involved in the process of drug resistance in cancer treatment. Beyond the link with cancer, some studies have demonstrated an association between ageing and aneuploidy being responsible for reduction of lifespan and premature ageing. However, despite being assign to aneuploidy a detrimental effect, in some organisms aneuploidy confer some beneficial adaptations such as resistance to drugs, keeping of a conserved process of release deleterious mutations and resistance to exogenous stresses. Owing to the impact of aneuploidy it becomes significant and necessary the understanding of the molecular mechanisms underlying aneuploidy and the genes involved in the genomic abnormally. In this work it was studied two novel candidate proteins involved in aneuploidy. C1orf112 and C12orf48 are poorly studied encoding protein genes which were considered potential cancer-related genes once they are overexpressed in cancer, were found co-expressed with cancer-related genes and are significant for cancer cell growth. Through classical molecular cloning techniques, the present work focused mostly on examine the role of C1orf112 and C12orf48 (also named PARPBP) proteins during cell cycle with special attention during mitosis in order to link or not these proteins with pathways of aneuploidy. Stable cell lines expressing the proteins with both GFP and HA-tags were created with the purpose of determine protein localization during cell cycle and look into partner proteins attempting to access biological function in the cell. The experimental work planned was limited by a huge difficulty in to obtain cell lines overexpressing both proteins and a great effort was putted into the increase of target protein concentration.The data yielded by this study allowed to determine the localization of C1orf112 which is present in the nucleus during interphase and does not have any specific localization during mitosis. Regarding PARPBP, data suggest that this protein is more expressed during mitosis. Current research was not enough to conclude about the role of C1orf112 and PARPBP in aneuploidy, the results are not inconsistent with this hypothesis, however further research is necessary.

Aneuploidia é considerada o defeito genético mais comum observado em humanos. A presença de um número anormal de cromossomas é a principal causa de abortos espontâneos e nos casos sobreviventes é responsável por atraso mental e desenvolvimento anormal. A ocorrência de erros durante a distribuição dos cromossomas aquando da divisão celular tem sido considerada o principal mecanismo na origem da aneuploidia e inclui defeitos no checkpoint do fuso mitótico, ligações merotélicas, amplificações centrosómicas e defeitos de coesão entre cromatídeos irmãos. Esta condição tem também sido associada ao desenvolvimento de muitos cancros, de tal forma que é considerada uma característica fundamental de cancro. Para além de estar presente na maior parte dos tumores sólidos, há algumas evidências de que a aneuploidia esteja envolvida na resistência a medicamentos durante a terapia do cancro. Para além da associação ao cancro, alguns estudos têm demonstrado uma associação entre aneuploidia e o envelhecimento, uma vez que esta é responsável pela redução da esperança média de vida e envelhecimento prematuro. No entanto, apesar de a aneuploidia ser descrita como prejudicial, em alguns organismos confere mecanismos de adaptação benéficos como por exemplo a resistência a drogas, o funcionamento como mecanismo de proteção contra mutações deletérias e a conferência de resistência a estresse exógeno. Devido ao impacto da aneuploidia previamente referidos, torna-se significativo e necessário a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à aneuploidia e a pesquisa dos genes responsáveis por esta falha genética. Este trabalho consistiu no estudo de duas novas proteínas potencialmente envolvidas na aneuploidia. C1orf112 e C12orf48 são dois genes que codificam para proteínas pouco estudadas e foram considerados como potencialmente envolvidos em cancro uma vez que são co-expressos com genes implicados em cancro e por serem importantes para o crescimento de linhas celulares cancerígenas. Através de técnicas de clonagem molecular, o presente trabalho focou-se essencialmente na determinação da função das proteínas C1orf112 e C12orf48 (também denominado PARPBP) durante o ciclo celular, com especial ênfase durante a fase mitótica, de forma a relacionar ou não estas proteínas com os mecanismos envolvidos em aneuploidia. Foram criadas linhas celulares estáveis que expressam ambos GFP e HA tags com o objectivo de determinar a localização das proteínas durante o ciclo celular, assim como investigar proteínas que interagem com elas de forma a tentar inferir a função biológica na célula. O trabalho experimental planeado ficou limitado por uma grande dificuldade em obter linhas celulares que sobre-expressassem ambas proteínas e foram realizados grandes esforços na tentativa de aumentar a concentração da proteína alvo em estudo. Os dados gerados por este trabalho permitiram determinar a localização de C1orf112 que está presente no núcleo durante a interfase e não apresenta localização específica durante a fase mitótica, na qual se encontra distribuída por toda a célula. No que diz respeito a PARPBP, os resultados sugerem que esta proteína é mais expressa durante a fase mitótica. Estes resultados não foram suficientes para tirar conclusões acerca do papel de C1orf112 e PARPBP na aneuploidia, no entanto os resultados não foram inconsistentes com esta hipótese e por esse motivo serão necessárias experiências adicionais para responder a esta questão.