The role of the small GTPase Saci_1563 in archaellum regulation

Abstract

Formally recognized approximately 40 years ago, Archaea is still the least studied of the three domains of life. Euryarchaeota and Crenarchaeota are the two major phyla of Archaea, and the most well understood, particularly because of the existence of genetic techniques that allow for their study. An important crenarchaeal model organism is Sulfolobus acidocaldarius, a motile aerobic thermoacidophile first isolated from terrestrial volcanic environments that thrives at around 75°C and pH 3. The archaellum – an organelle functionally similar to the bacterial flagellum, but structurally and genetically different – is responsible for the locomotion of motile archaeal species. In recent years it has been found that the expression of this organelle depends on environmental factors, and starvation in particular is associated with archaella induction in S. acidocaldarius. The signal transduction of nutrient depletion to archaella expression is not fully understood, but recently some key players of the archaellum regulatory network have been uncovered. Specifically, ArnA and ArnB were found to be negative regulators of archaella expression. Moreover, both proteins were found to be phosphorylated, which points at the existence of a multi-level regulatory system. Saci_1563 is a protein conserved in several Crenarchaeota species that was found to be co-purified with ArnA. This protein is a putative GTP-binding protein, a class of proteins implicated in the regulation of several biological phenomena and in cell signalling. It is thus plausible that Saci_1563, by acting as a molecular switch, is implicated in the fine tuning of archaella expression in response to specific signals. In this study we assessed the biological role of Saci_1563 and its biochemical characterization. Protocols for the heterologous purification of this protein in Escherichia coli and for the purification of over-expressed protein in S. acidocaldarius were optimised. The purified protein was then subject to phosphate release assays to test for its GTP-binding ability. The impact of saci_1563 deletion on S. acidocaldarius motility was tested, and the influence of starvation on saci_1563 expression was determined. Moreover, we analysed the effect of saci_1563 deletion on the expression of proteins belonging to the archaellum regulatory network and to the archaellum operon. The results reported in this thesis are far from conclusive. A role for Saci_1563 in archaella regulation cannot be excluded, but other venues of research regarding this protein are suggested.

Reconhecido formalmente há cerca de 40 anos o domínio Arqueia é, dos três domínios da vida, o menos estudado. Os filos Euryarchaeota e Crenarchaeota compreendem os organismos melhor caracterizados deste domínio e, no filo Crenarchaeota, o termoacidófilo Sulfolobus acidocaldarius é um dos organismos modelo que tem permitido mais desenvolvimentos nesta área da microbiologia. Este organismo móvel e aeróbico tem por habitat ambientes terrestres vulcânicos e por condições ótimas temperaturas de cerca de 75°C e pH 3. O arcaelo – um apêndice funcionalmente semelhante ao flagelo bacteriano, mas estrutural e geneticamente distinto – é responsável pela locomoção arqueana. Atualmente sabe-se que certos fatores ambientais estimulam a expressão do arcaelo. Em S. acidocaldarius, em particular, condições de subnutrição levam à expressão do arcaelo. Algumas proteínas envolvidas na rede regulatória do arcaelo já se encontram identificadas. Duas dessas proteínas – ArnA e ArnB – reprimem a sua expressão. As propriedades de ambas as proteínas podem ser alteradas por fosforilação, o que indica que a regulação do arcaelo ocorre a vários níveis hierárquicos. A proteína Saci_1563, anotada como uma GTPase, encontra-se conservada em várias espécies pertencentes ao filo Crenarchaeota e foi detetada após a sua co-purificação com ArnA. Dado o papel das GTPases na regulação de diversos processos celulares, é plausível que esta proteína de alguma forma module ArnA e, consequentemente, a expressão do próprio arcaelo. De modo a caracterizar bioquimicamente esta proteína otimizaram-se protocolos para a sua purificação a partir de Escherichia coli e de S. acidocaldarius. As amostras obtidas foram utilizadas para avaliar a capacidade de hidrólise de GTP desta proteína. A influência da ausência de nutrientes no meio na expressão de saci_1563 foi estudada numa estirpe de S. acidocaldarius. Uma estirpe mutante que não possui o gene para Saci_1563 foi também utilizada de modo a determinar de que modo a ausência desta proteína influencia a expressão de outras proteínas associadas ao arcaelo ou à regulação da sua expressão. O efeito da ausência de Saci_1563 na locomoção de S. acidocaldarius foi também determinado. Os resultados aqui apresentados não são de modo algum definitivos. Apesar de não ter sido possível atribuír um papel a Saci_1563 no que toca à regulação do arcaelo, não é também possível excluir completamente um papel regulatório por parte desta proteína. Por este motivo, no final sugerem-se vias de investigação alternativas para compreender esta biomolécula.