Biomaterials for cartilage tissue engineering under mechanical stimulus

Abstract

Tissue engineering is being explored as a suitable strategy to repair tissues that have no capability of regenerating by themselves, such as articular hyaline cartilage in the knee. This strategy involves the combination of cells and scaffold biomaterials, able to support the adhesion of cells and their guidance into differentiation. In the knee, the scaffolds have to bear cyclical stress and compressive loading. Therefore, the mechanical properties of the scaffolds are a key component to understand their performance in animal models and clinical trials. In this work, a new methodology has been developed to analyze the mechanical properties of scaffolds for cartilage tissue engineering by studying the fatigue behavior of macroporous poly-ε-caprolactone PCL scaffolds under cyclic loading in different conditions. The PCL scaffolds in dry state were compared with scaffolds under immersion in water, in order to determine the hydrodynamic effects in resistance to fatigue by analyzing the evolution of the dissipated energy with the help of the Morrow’s model. Moreover, the effect of fibrin hydrogel inside the pores was determined. This has been performed due to the fact that fibrin is a component in chirurgical interventions and can be a suitable matrix for cell differentiation in tissue engineering. It was found that water inside the pores plays a critical effect improving resistance to fatigue. On the other hand, the fibrin clot does not represent a relevant factor in determining the mechanical properties, when compared with water. The same analysis was carried out in PCL scaffold combined with poly(vynil-alcohol) PVA hydrogel, an in vitro model of growing tissue inside the pores, in order to study how the addition of a third material resembling some aspects of tissue, can affect the mechanical response. It was concluded that the resistance to fatigue improved when the PVA hydrogel increased in stiffness. Further, the experimental data deviated from the model after few cycles, meaning that unknown effects were taking place inside the pores. This methodology was also implemented in scaffolds with chondrogenic precursors seeded inside the pores in order to study the variations in the fatigue behavior due to the produced extracellular matrix. To simulate some mechanical conditions during cell culture, a bioreactor was designed, capable of applying mechanical compression in multiple samples at the same time. The fabrication of the bioreactor implied the development of the corresponding electronics and mechanics suited to cell incubator environment, as well as sterility tests. Thus, PCL scaffolds were seeded with chondrogenic precursor cells and fibrin and some of them were submitted to free swelling and others to cyclic loading in the bioreactor. All the samples were analyzed for fatigue. Moreover, some components of the extracellular matrix were identified. No differences were observed between samples undergoing free swelling or loading conditions, neither respect to matrix components nor to mechanical performance to fatigue. The extracellular matrix did not achieve in any case all the desired chondrogenic traits. However, an interesting fact was found: when compared with PCL and PCL with PVA under immersion, the extracellular matrix properties improved fatigue resistance, despite the fact that the measured elastic modulus at the first cycle was similar in all the cases. This is interesting as it corroborates the hypothesis that fatigue analysis in tissue engineering constructs can provide additional information missed with traditional measurements. Different factors in these constructs, from the porosity – that influences, among others, water uptake - , to the characteristics of the hydrogel or cellular matrix within them, determine the evolution of fatigue resistance to specific cyclic loading. These effects should be considered for developing predictive models that provide information beyond the traditional mechanical measurements in cartilage tissue engineering.

A engenharia de tecidos está a ser explorada como uma estratégia adequada para a reparação de tecidos que não possuem a capacidade de regenerarem-se, como por exemplo, a cartilagem hialina do joelho. Esta estratégia combina células e biomateriais (scaffolds), com a capacidade de suportar a adesão das células e a sua diferenciação. No joelho, os scaffolds têm de suportar tensões e cargas de compressão cíclica. Desta forma, as propriedades mecânicas dos scaffolds são um fator chave para perceber o seu desempenho em modelos animais e ensaios clínicos. Neste trabalho, foi desenvolvida uma nova metodologia para analisar as propriedades mecânicas dos scaffolds para engenharia de tecidos de cartilagem, através do estudo do comportamento de fadiga dos scaffolds macroporosos de poli-ε-caprolactona (PCL) sob cargas cíclicas em diferentes condições. Os scaffolds de PCL secos foram comparados com scaffolds imersos em água para determinar os efeitos hidrodinâmicos na resistência à fadiga, analisando a evolução da energia dissipada com ajuda do modelo de Morrow. Além disso, o efeito de um hidrogel de fibrina no interior dos poros também foi determinado. A utilização da fibrina prende-se com o facto de esta ser um compoente usado em intervenções cirúrgicas, sendo também uma matriz adequada para a diferenciação celular em engenharia de tecidos. Verificou-se ainda que a água no interior dos poros possui um efeito crítico na melhoria da resistência à fadiga. Por outro lado, o coágulo de fibrina não representa um fator determinante nas propriedades mecânicas, quando comparado com a água. A mesma análise foi realizada em scaffolds de PCL combinados com um hidrogel de poli(vinil-álcool) – PVA, um material que serve como modelo in vitro de tecido em crescimento dentro dos poros, de forma a estudar como a adição de um terceiro material, semelhante ao tecido, pode afetar a resposta mecânica. Assim, foi possível concluir que a resistência à fadiga melhora com o aumento da rigidez do hidrogel de PVA. Além disso, verificou-se que os dados experimentais sofreram um desvio relativamente aos dados do modelo teórico após poucos ciclos, o que significa que sucederam efeitos indeterminados no interior dos poros. Esta metodologia foi também aplicada em scaffolds com precursores condrogênicos colocados no interior dos poros, com o objetivo de estudar as variações no comportamento de fadiga causado pela matriz extracelular produzida. Para simular algumas das condições mecânicas durante o cultivo celular foi desenvolvido um bioreactor com a capacidade de aplicar uma compressão mecânica a múltiplas amostras ao mesmo tempo. O fabrico do bioreactor implicou o desenvolvimento das correspondentes partes eletrónica e mecânica, adequadas ao ambiente da incubadora de células, assim como aos testes de esterilização. As células precursoras condrogênicas foram introduzidas nos scaffolds de PCL com fibrina, sendo parte deles submetidos a condições estáticas sem carga e outros com cargas cíclicas através da utilização do bioreactor. O comportamento de fadiga foi analisado para todas as amostras. Alguns componentes da matriz extracelular foram identificados. Verificou-se que comparando as amostras obtidas em condições estáticas e dinâmicas, nenhuma diferença foi encontrada quer para as propriedades mecânicas quer nas componentes da matriz. Além disso, constatou-se que a matriz extracelular não chegou a obter as características condrogênicas desejadas em nenhuma dessas amostras. Contudo, um facto interessante foi observado: aquando a comparação com as amostras de PCL em imersão com PVA, as propriedades da matriz extracelular melhoram a resistência à fadiga, apesar do módulo elástico medido no primeiro ciclo ser semelhante em todas as amostras. Isto é interessante uma vez que reforça a hipótese de que a análise da fadiga em engenharia de tecidos pode fornecer informações adicionais relativamente às medições tradicionais. Os diferentes fatores nestas amostras, desde a porosidade – que influência, entre outros, o movimento da água no interior do scaffold – até às características do hidrogel ou da matriz no seu interior, determinam a evolução da resistência à fadiga para uma carga cíclica específica. Estes efeitos devem ser considerados para o desenvolvimento de modelos de previsão que forneçam informação para além das medições mecânicas tradicionais em engenharia de tecidos da cartilagem.