Modelo in vitro para o estudo da isquemia e reperfusão cardíacas

Abstract

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte em todo o mundo, sendo a isquemia cardíaca a mais preocupante. A isquemia pode ser definida como a redução do fluxo sanguíneo, que dá origem a um deficiente aporte de oxigénio ao coração. Para evitar lesões no tecido isquémico é necessário restabelecer o fluxo sanguíneo, processo designado por reperfusão. Embora a reperfusão seja crucial para restabelecer a oxigenação esta pode culminar em danos irreversíveis no miocárdio. O objectivo do presente trabalho foi a implementação de um modelo in vitro para o estudo da isquemia e reperfusão cardíacas, utilizando os cardiomiócitos H9c2, baseado na actividade de duas enzimas GOX/CAT que geram uma atmosfera de hipóxia. Esta metodologia foi comparada com a que utiliza um agente químico indutor de hipóxia, o cloreto de cobalto (CoCl₂). Foi também testado o efeito de um antioxidante de referência. Os resultados mostraram que a indução de hipóxia pelo sistema GOX/CAT foi mais rápida, levando a uma redução de 40% na proliferação celular em 16h comparativamente a uma redução de 30% observada com o CoCl₂ (200μM) após 48h, avaliada por SRB. Este decréscimo na proliferação celular correlaciona-se com a morte celular que se mostrou ser maioritariamente apoptótica em ambas as condições, conforme avaliado por marcação com Hoechst/PI e condensação nuclear. Após indução de hipóxia realizou-se uma renovação do meio de cultura por mais 24h, de modo a mimetizar a situação de reperfusão. Verificou-se que a recuperação obtida com o sistema enzimático foi muito mais pronunciada que a recuperação pouco exuberante observada com o agente CoCl₂. Posto isto, o sistema GOX/CAT mostrou-se uma excelente metodologia, pela sua eficácia e reprodutibilidade, para mimetizar o estudo in vitro a isquemia e reperfusão. Foi também testado o efeito de um antioxidante de referência, o Trolox, na situação de isquemia. Este mostrou proteger os cardiomiócitos da hipóxia induzida pelo sistema GOX/CAT, revertendo o decréscimo observado na proliferação celular e concordantemente o número de núcleos apoptóticos. Na sua globalidade, os resultados obtidos demonstraram que o sistema enzimático utilizado é adequado ao estudo da isquemia e reperfusão cardíacas em cultura celular, abrindo caminho a explorar os benefícios de novos antioxidantes capazes de ultrapassar a insuficiência cardíaca e aumentar a sobrevivência dos pacientes após enfarte do miocárdio.

Cardiovascular diseases are one of the main causes of death worldwide, among them cardiac ischemia is the most worrying pathology. Ischemia can be defined as the reduction of blood flow, giving rise to a deficient oxygen flow to the heart. In order to save the ischemic tissue, it is necessary to reestablish the blood flow, which is desig-nated as reperfusion. Although reperfusion is crucial to restore oxygenation it can cul-minate in irreversible damages to the myocardium. The aim of the present work was the implementation of an in vitro model for the study of cardiac ischemia and reperfusion, using H9c2 cardiomyocites, based on the activity of two enzymes GOX/CAT that generate an hypoxic atmosphere. This methodology was compared with the hypoxia-inducing chemical agent (CoCl2). Addi-tionally, the effect of a reference antioxidant was tested. The results showed that hypoxia induction by the GOX/CAT system was faster, resulting in a reduction of 40% in cell proliferation after 16h in comparison to a 30% reduction observed with a 48h incubation with CoCl2 (200μM) assessed by SRB assay. This decrease in cell proliferation is correlated with cell death, which demonstrated to be in its majority apoptotic in both conditions, evaluated by Hoechst/PI staining and by nuclear condensation. After hypoxia induction medium refreshment for more 24h was performed, in order to mimic reperfusion. It was verified that the recuperation obtained with the enzymatic system was much more pronounced than the recuperation observed with CoCl₂. Taking these results into account, the GOX/CAT system has proved to be an ex-cellent methodology due to its efficacy and reproducibility in mimicking ischemia and reperfusion in vitro. Also, the effect of a reference antioxidant, Trolox, in ischemia was tested. This antioxidant protected cardiomyocites from GOX/CAT system-induced hypoxia, revert-ing the decrease observed in cell proliferation and, concordantly, the number of apop-totic nuclei. All in all, the obtained results have demonstrated that the enzymatic system used is adequate for the study of ischemia and reperfusion in cell culture, giving way to the exploration of the benefits of novel antioxidants capable of overcoming cardiac insufficiency and of increasing the survival of patients after myocardium infarction.