Construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes para Isópodes marinhos (Crustacea - Isopoda) de Portugal e da Macaronésia

Abstract

Apesar de a ordem Isopoda constituir um dos mais diversos grupos de crustáceos presentes em vários habitats marinhos, o conhecimento sobre a sua biodiversidade ainda é insuficiente, comprometendo o planeamento de estratégias de gestão de meios marinhos. A utilização de bibliotecas de referência de DNA barcodes (sequências de DNA obtidas a partir da extremidade 5’ do gene mitocondrial da sub-unidade I do citocromo oxidase, COI-5P) para auxiliar a identificação e a catalogação de macro invertebrados bentónicos marinhos tem contribuído para a melhoria do conhecimento sobre a composição e distribuição espacial destas comunidades, possibilitando o recurso a técnicas de sequenciação de segunda geração para agilização de métodos de monitorização. Este estudo teve como objetivos: 1) a compilação e elaboração de uma lista atualizada (“checklist”) de espécies de isópodes marinhos registados em Portugal continental e nos arquipélagos dos Açores e Madeira; 2) contribuir para a construção de uma biblioteca de DNA barcodes de isópodes marinhos das mesmas regiões. A elaboração da lista resultou na compilação de 146 espécies registadas desde zonas de mar profundo a zonas costeiras e estuarinas. Para a construção de uma biblioteca de referência de DNA barcodes de isópodes foram identificados 250 espécimes e geradas 105 sequências, resultantes de sequenciação bidirecional englobando 26 morfoespécies, distribuídas por 32 MOTU´s, recolhidas em vários pontos do Atlântico Nordeste, maioritariamente ao longo da costa de Portugal e da Galiza e nos arquipélagos dos Açores, Canárias e Madeira. Todos os espécimes foram catalogados na base de dados BOLD, incluindo dados sobre identificação taxonómica, dados de colheita e respetivas sequências e cromatogramas. De modo a garantir a qualidade dos resultados foram compiladas 60 sequências publicadas para comparação e classificação das sequências obtidas. As divergências intraespecíficas para os espécimes analisados variaram entre os 0 e os 2,8%, com uma divergência interespecífica média de 29%, variando entre 12% e 59%, comprovando-se a capacidade de descriminação do fragmento COI-5P para as espécies de isópodes em estudo. Foram encontradas 2 linhagens alopátricas de Campecopea lusitanica com 22% de divergência, e 3 linhagens de Dynamene edwardsi separadas entre a costa de Portugal e os arquipélagos da Madeira e Canárias com divergências entre os 18% e 21%.

Although the order Isopoda constitutes one of the most diverse groups of crustaceans, ocurring in a wide range of marine habitats and transition ecosystems, a rigorous and extensive knowldege of its biodiversity has not been reached yet, which may compromise the informed planning and management of the marine environment. The use of DNA barcodes (DNA sequences from the 5´end of the mitochondrial gene cytochrome oxydase I, or COI-5P) reference libraries to aid species identification and inventories of marine macroinvertebrates, has contributed to an improved knowledge of the composition and distribution of these communities, and enabled possible uses of second generation sequencing in in high-throughput monitoring methods. The objectives of this study were: 1) the compilation of an updated checklist for marine isopod species registed in Portuguese continental waters, and the archipelagos of Azores and Madeira; 2) contribute to the construction of a reference library of DNA barcodes for marine isopods from the same regions. The checklist compiles 146 species recorded in a variety of habitats, from deep-sea to coastal, estuarine and lagunar systems. As for the construction of the DNA barcode reference library we obtained 105 DNA sequences, resulting from bidirecional sequencing, assigned to 26 morphospecies and distributed in 32 MOTU´s, from specimens collected along the Northeast Atlantic, mostly along the coast of Portugal and Galiza and in the archipelagos of Azores, Canary and Madeira. Specimens were cataloged in the BOLD database with taxonomic information, collection data, and respective sequence and cromatograms. To assure the quality of the obtained data, 60 published COI-5 sequences were mined to compare and classify the sequences here generated. Intraspecific divergences ranged from 0 to 2,8% for the analysed specimens, and mean interspecific divergence was 29%, (ranging from 12% to 59%), globally confirming the species diagnosis ability of COI-5P barcodes for these isopod species. In addition, we detected two alopatric lineages of Campecopea lusitanica with a divergence of 22%, as well as three divergent lineages of Dynamene edwardsi which split among the west coast of Portugal and the archipelagos of Madeira and Canaries with a divergence ranging between 18 and 21%. The analises of partial sequences from the nuclear gene 18s rRNA of lineagerepresentative specimens of D. edwardsi confirmed the patterns observed with COI-5P.