Functional characterization of the grapevine aquaporin VvXIP1

Abstract

The diffusion of water and small solutes through biological membranes is facilitated by aquaporins, members of the Major Intrinsic Proteins (MIPs) superfamily. As sessile organisms, plant species have been found to have more aquaporin genes than organisms from the other kingdoms of life. Among all the variety of MIPs, a subfamily called Uncharacterized Intrinsic Proteins (XIP) has been recently described in several fungi and eudicot plants. In the present study, the localization, expression and functional characterization of the grapevine VvXIP1 were performed. Phylogenetic analysis revealed that VvXIP1 is evolutionarily close to XIPs from cotton and peach. Co-localization studies with ZmPIP2;5-GFP and VvXIP1-RFP fusion proteins in transiently transformed Nicotiana bethamiana leaves after infection with Agrobacterium tumefaciens revealed that VvXIP1 is intracellular, and location prediction with the tool PredictProtein suggests that it locates in the tonoplast. Stopped flow spectrometry was used to evaluate water transport capacity of VvXIP1 in microsomal vesicles purified from the yeast strain YSK1172 transformed with the construct pVV214-VvXIP1. Results showed that VvXIP1 is unable to transport water but mediates glycerol transport. Growth experiments of the transformed yeast on solid media revealed that VvXIP1 is able to transport (besides glycerol) copper and H2O2. Furthermore, when CM-H2DCFDA was used to measure H2O2 uptake by spectrofluorimetry, yeast cells expressing VvXIP1 showed a much higher rate of fluorescence increase after H2O2 addition than control cells transformed with the empty vector. Similarly, VvXIP1-transformed yeasts showed a 3.5 - fold higher rate of O2 production than the control, as measured with a Clark electrode, when H2O2 was added to the incubation media. Both results strongly corroborated that VvXIP1 is able to transport H2O2. Additional growth experiments in solid media with 2.1 M sorbitol showed that the yeast transformed with the construct pVV214-VvXIP1 exhibited higher water stress sensitivity than the yeast transformed with the empty vector. To provide further insights into gene function, the expression of VvXIP1 was studied by qPCR in different organs and in response to different treatments/stressors. Results showed VvXIP1 steady-state transcript levels were much higher in leaves than in berries, canes or flowers from field grown cv. Vinhão grapevines. Moreover, VvXIP1 expression was downregulated in leaves from potted grapevines cv. Aragonez submitted to severe water deficit. In agreement, VvXIP1 was downregulated by ABA and salt stress in in vitro cultured cells. Based on the observation that VvXIP1 is able to transport copper, the steady-state levels of the corresponding mRNA were measured in cv. Vinhão leaves from field-grown grapevines treated with the copper based fungicide Bordeux Mixture. The observed downregulation of the expression of VvXIP1 should have major importance in plant response to copper toxicity, contributing do the regulation of the intracellular levels of the heavy metal in coordination with the copper transporters VvCTrs recently studied in our group.

A difusão da água e de pequenos solutos através da membrana biológica é facilitada por aquaporinas, membros da superfamília Major Intrinsic Proteins (MIPs). Como organismos imóveis, as plantas possuem um número maior de genes de aquaporinas que os organismos de outros reinos. De entre todos os membros da superfamília MIP, uma subfamília, denominada Uncharacterized Intrinic Proteins (XIPs), foi recentemente descrita em fungos e plantas dicotiledóneas. No presente trabalho de tese foi estudada a localização e a função da proteína VvXIP1 de videira, bem como os níveis de expressão do mRNA correspondente em diferentes tecidos. A análise filogenética revelou que a proteína VvXIP1 é evolutivamente próxima de XIPs de algodão e pessegueiro. Os estudos de localização subcelular envolveram uma abordagem de transformação transiente de folhas de Nicotiana bethamiana por infiltração com Agrobacterium tumefaciens. Os resultados mostraram que a fluorescência verde da fusão ZmPIP2;5-GFP se localizava na membrana plasmática, ao contrário da fluorescência vermelha da fusão VvXIP1- RFP localizada provavelmente ao nível do tonoplasto, tal como previsto pela ferramenta bioinformática PredictProtein. A técnica “stopped flow” foi utilizada para avaliar a capacidade da aquaporina VvXIP1 transportar água em vesículas microssomais purificadas de células da estirpe de levedura YSK1172 transformada com o plasmídeo pVV214 - VvXIP1. Os resultados mostraram que a aquaporina é incapaz de transportar a água, mas é permeável ao glicerol. Estudos de crescimento em placa da levedura transformada mostraram que VvXIP1 é capaz de transportar cobre e H2O2 para além do glicerol. Quando se utilizou a sonda fluorescente CMH2DCFDA para medir por espectrofluorimetria a incorporação de H2O2, os resultados mostraram que as células da levedura a expressar a proteína VvXIP1 proporcionaram um aumento maior de fluorescência do que o controlo quando se adicionou H2O2 ao meio de reação. Em paralelo, estudos com o eléctrodo de Clark mostraram que a levedura a expressar a proteína VvXIP1 produzia mais O2 que a levedura transformada com o vector vazio após a adição de H2O2 ao meio de reação. Ambas a evidências experimentais suportaram que a aquaporina VvXIP1 é capaz de transportar H2O2. A estirpe de levedura transformada com o plasmídeo pVV214 - VvXIP1 mostrou ainda uma sensibilidade aumentada ao stresse hídrico que a levedura transformada com o plasmídeo vazio. Para obter uma melhor compreensão da função do gene VvXIP1, os níveis de expressão foram estudados por qPCR em diferentes órgãos e em resposta a diferentes tratamentos / stresses. Em videiras da casta Vinhão de uma vinha comercial o gene VvXIP1 foi mais expresso nas folhas do que em bagos, canas ou flores. Foi ainda observado que a expressão do gene VvXIP1 foi regulada negativamente em folhas de videiras envasadas da casta Aragonez submetidas a stresse hídrico severo. Em paralelo, em culturas celulares de videira a produção de mRNA foi regulada negativamente por 150 μM de ABA e 200 mM de NaCl. Por se ter descoberto que VvXIP1 é capaz de transportar cobre, foram medidos os níveis de mRNA em folhas de videiras da casta Vinhão tratadas com a Calda Bordalesa que é um fungicida à base de cobre. A diminuição observada dos níveis de transcritos de VvXIP1 pode constituir uma resposta da planta à toxicidade do cobre, contribuindo para a regulação dos níveis intracelulares do metal pesado em coordenação com os transportadores de cobre VvCTrs recentemente estudados no nosso grupo de investigação.