Exploring galectin-3-KRASmut-p16ink4a interplay in colorectal cancer

Abstract

KRAS is the most frequently mutated RAS isoform in many cancers, including colorectal cancer (CRC; 30-50% of the cases), which is a leading cause of death worldwide. Hotspot mutations on this oncogene on codons 12, 13 and 61, mainly resulting in G12V, G12D or G13D substitutions, have an important impact on therapy-related decisions. KRAS signalling nanoclusters are stabilized by the scaffold protein galectin-3 (Gal-3). Gal-3, the only chimaera-type galectin within the galectin family, has numerous intra and extracellular ligands, playing central roles in many cellular functions. Alterations in Gal-3 expression profile are correlated to a variety of cancers, including CRC, being involved in cancer cell growth, transformation, apoptosis, angiogenesis, adhesion, invasion and metastasis. Gal-3 mediated transformation is partially attributed to its specific interaction with KRAS and consequent activation of its downstream signalling effectors. The phenotypic outcomes of this interaction are not well established and thus constitute an important subject of research, with possible therapeutic implications. On its turn, p16 is a well-known tumour suppressor, which plays several additional roles, including in the regulation of angiogenesis, apoptosis, anoikis, immortalization and senescence. p16 seems to be related with KRAS and Gal-3, exerting its tumour suppressor function by downregulating both proteins to achieve cancer cell anoikis resistance reversion. It is possible to infer that KRAS and Gal-3 have a mutual and dual relationship, and that p16 downregulates both Gal-3 and KRAS, nevertheless, there is very limited knowledge about the Gal-3/KRAS/p16 interplay. In this project we aimed to understand if there is a direct interaction between these three proteins in CRC cell lines and to explore the effect of KRAS and/or Gal-3 silencing in their interplay and in cancer-associated phenotypic characteristics. For that purpose we used SW480 and HCT116 CRC-derived cell lines, the normal colon cell line NCM460 and four others NCM460-derived cell lines previously transfected with Flag-KRASwt and FLAG-KRAS harbouring hotspot mutations: Flag-KRASG12V, Flag-KRASG12D and Flag-KRASG13D. In conclusion, this work provides, for the first time, evidences that support the existence of a biochemical interaction between Gal-3, KRAS and p16 in the CRC model, establishing a new research field that requires further exploration. Our data also suggest that KRAS can constitute a good target for new therapeutic strategies in CRC, as it impairs various cancer hallmarks.

O KRAS é a isoforma RAS mais frequentemente mutada em vários cancros, incluindo no cancro colorretal (CCR; 30-50% dos casos), que é uma importante causa de morte em todo o mundo. As mutações mais frequentes neste oncogene, mutações pontuais nos codões 12, 13 e 61, que maioritariamente resultam em substituições G12V, G12D, ou G13D, têm um impacto importante nas decisões terapêuticas. As plataformas de sinalização KRAS na membrana são estabilizadas pela proteína galectina-3 (Gal-3). Gal-3, a única galectina tipo “quimera” dentro da família das galectinas, tem inúmeros ligandos intra e extracelulares, desempenhando papéis centrais em várias funções celulares. Alterações no perfil de expressão da Gal-3 estão correlacionadas com uma variedade de tumores, incluindo CCR, estando envolvidas no crescimento tumoral, transformação, apoptose, angiogénese, adesão, invasão e metastização. A transformação mediada pela Gal-3 é parcialmente atribuída à sua interação específica com KRAS e consequente ativação das suas vias de sinalização. Os resultados fenotípicos dessa interação não estão bem estabelecidos, constituindo assim um importante tema de investigação com possíveis implicações terapêuticas. Por sua vez, p16 é um conhecido supressor tumoral que desempenha vários papéis adicionais, inclusivamente na regulação da angiogénese, apoptose, anoikis, imortalização e senescência. A p16 parece estar relacionada com KRAS e Gal-3, exercendo a sua função de supressão tumoral por regulação negativa de ambas as proteínas para atingir reversão de resistência a anoikis. Assim, é possível inferir que a KRAS e a Gal-3 têm uma relação mútua e dupla, e que a p16 regula negativamente tanto Gal-3 como KRAS, no entanto, o conhecimento sobre a interação p16/KRAS/Gal-3 é muito limitado. Neste projeto pretendíamos compreender se existe uma interação direta entre estas três proteínas em linhas celulares de CCR e explorar o resultado do silenciamento de KRAS e/ou Gal-3 nessa interação e em características fenotípicas tumorais. Com esse objetivo usamos as linhas celulares derivadas de CCR SW480 e HCT116, uma linha celular de cólon normal NCM460 e quatro outras linhas celulares derivadas da NCM460 anteriormente transfectadas com Flag-KRASwt e FLAG-KRAS com as mutações mais frequentes: Flag-KRASG12V, Flag-KRASG12D and Flag-KRASG13D. Este trabalho fornece pela primeira vez, evidências a favor da existência de uma interação bioquímica entre Gal-3, KRAS e p16 no modelo CRC, estabelecendo um novo conceito que definitivamente deve constituir objeto de investigação futura. Sugerimos também que o KRAS pode constituir um bom alvo para novas estratégias terapêuticas no CCR, na medida em que pode afetar vários hallmarks tumorais.