Phenotypic profiling of several strains of Pseudomonas aeruginosa : identification of potential virulence determinants

Abstract

Numerous studies have described that bacteria display higher resistance to antimicrobials when growing in biofilm mode of growth, however the phenotypic and virulence factors changes associated with this increased resistance are still poorly understood. The goal of this study was to enlarge the knowledge about the augmented biofilmrelated resistance of Pseudomonas aeruginosa characterizing phenotypically P. aeruginosa biofilms formed by different strains in order to find whether these bacterial biofilms display a common profile. This bacterium is a common opportunistic pathogen that is often related with persistent infections that cause high rates of patient morbidity and mortality due to its intrinsic resistance to several antimicrobials and great adaptive resistance to environmental stimuli. The experimental analysis consisted of a phenotypical examination comprising biofilm formation ability, susceptibility to antibiotics (ciprofloxacin and colistin), expression of several virulence factors (motility, toxin production, and slime production), and phenotypic switching. To best replicate real-world circumstances this work comprised the study of several P. aeruginosa strains: four reference strains (PAO1, ATCC 10145, CECT 111, and PA14) and three clinical isolates (PAI1, PAI2, and PAI3). Biofilms are often related with augmented resistance to antimicrobial agents and are usually associated with chronic infections, which are difficult to eradicate. Therefore, in this study, antibiotic susceptibility was tested and related with P. aeruginosa strains biofilm-forming ability. Results showed that an improved biofilm-forming ability does not seem to be related with biofilm resistance since the seven P. aeruginosa strains showed identical resistance and susceptibility profiles against ciprofloxacin and colistin, respectively, with the exception of PAI3 which exhibited higher resistance to ciprofloxacin. P. aeruginosa motility has been pointed out as a relevant factor for adhesion and biofilm development and also increased virulence. Thus, the swimming, swarming and twitching abilities of P. aeruginosa were evaluated. P. aeruginosa strains presented specific ability to move along surfaces. However, it was not found a clear relationship between higher motility and biofilm-forming ability and increased resistance. Similarly, slime production also contributes to biofilm development and is often implied in increased biofilm-resistance. Considering the results obtained, it was not found a evident relationship between slime production and both biofilm-forming ability and increased resistance. The ability to produce and release extracellular toxins by P. aeruginosa is frequently related with higher levels of bacterial pathogenicity which can lead to severe consequences and even death. Among the several extracellular toxins, hemolysin and pyocyanin production were assessed in this study. Each P. aeruginosa strain displayed a different expression of these virulence factors. It was not possible to conclude if any P. aeruginosa strain was more virulent than other based only on these results. Phenotypic switching is an usual adaptive mechanism used by P. aeruginosa to increase their diversity and overcome exposure to stress conditions and environmental changes. Because colony morphology variation is the most visible characteristic of phenotypic switching, both planktonic and biofilm colonies were observed in order to establish where there is a relationship between bacterial mode of growth and colony morphology and also biofilm resistance. It was observed that phenotypic switching occurred when the P. aeruginosa strains changed their way of growth to biofilm-form. The rising of small-colony morphotypes was recorded for some P. aeruginosa strains (PAO1, ATCC 10145, PA14, PAI1, and PAI3) when growing in biofilm-form, a morphotype usually associated with biofilm resistance. However it was not found a clear relationship with the rising of these small-colony variants and biofilm resistance and further studies are needed to better understand and establish the relationship of biofilm resistance and these morphotype variants. This work contributed to a further understanding of P. aeruginosa biofilm characteristics, including resistance features, virulence factors expression and phenotypic variation. It was concluded that there is not a general P. aeruginosa biofilm profile. Although resistance and susceptibility profiles against ciprofloxacin and colistin, respectively, of all strains were very similar, all virulence factors evaluated showed to be variable characteristic among all strains tested. In addiction it was not verified direct correlations between all virulence factors studied. Because there was recorded a variability in the virulence factors studied among all strains, no strain was considered more virulent than other given strain. Furthermore, results also show that there is an urgent necessity to reexamine the current clinical guidelines. These guidelines should regard phenotypic switching, intrinsic responses of biofilms and virulence factors presented by P. aeruginosa biofilms, characteristics with therapeutical impact.

Ao longo dos últimos anos, vários estudos têm descrito que as bactérias demonstram uma maior resistência quando crescem em biofilmes. No entanto, as mudanças fenotípicas e os factores de virulência que apresentam e que se encontram associados com o aumento desta resistência são ainda pobremente compreendidos. O objectivo do presente estudo foi alargar o conhecimento acerca do aumento da resistência associada aos biofilmes de Pseudomonas aeruginosa e caracterizando fenotipicamente biofilmes formados por diferentes estirpes com o intuito de compreender se estes apresentavam um perfil de biofilme idêntico. P. aeruginosa é um agente patogénico oportunista muito comum que frequentemente se encontra associado a infecções persistentes que causam elevadas taxas de morbidade e mortalidade nos pacientes infectados devido à sua resistência intrínseca e à sua elevada resistência adaptativa a estímulos ambientais. A análise experimental consistiu na caracterização fenotípica de biofilmes, nomeadamente, a capacidade de formação de biofilme, susceptibilidade a antibióticos (ciprofloxacina e colistina), a expressão de vários factores de virulência e variação fenotípica. Para melhor replicar as condições reais este trabalho incluiu o estudo de várias estirpes de P. aeruginosa: quatro estirpes de referência (PAO1, ATCC 10145, CECT 111 e PA14) e três isolados clínicos (PAI1, PAI2 e PAI3). Os biofilmes encontram-se frequentemente associados com resistência aumentada a antimicrobianos e estão tipicamente relacionadas a infecções crónicas, muito difíceis de erradicar. Assim, neste trabalho, a susceptibilidade a dois antibióticos de uso clínico (ciprofloxacina e colistina) foi testada e relacionada com a habilidade de formação de biofilme das estirpes de P. aeruginosa de maneira a melhor compreender a resistência associada a biofilmes. No entanto, os resultados observados demonstraram que uma melhor habilidade de formação de biofilme não confere uma maior resistência a antibióticos, pois todas as estirpes de P. aeruginosa estudadas apresentaram perfis de susceptibilidade idênticos relativamente a ambos os antibióticos testados, com a excepção da estirpe PAI3 que revelou maior resistência à ciprofloxacina do que as restantes estirpes. A motilidade da P. aeruginosa tem sido apontada como um factor relevante para adesão, desenvolvimento de biofilme e virulência aumentada desta bactéria. Três tipos de motilidade comummente exibidos pela P. aeruginosa foram avaliados neste trabalho. Todas as estirpes de P. aeruginosa estudadas apresentaram habilidades específicas de se mover ao longo de superfícies. No entanto, não foi estabelecida uma relação clara entre uma maior motilidade e habilidade de formação de biofilme e resistência aumentada. A produção de matriz (“slime”) está também envolvida no desenvolvimento do biofilme e muitas vezes é implicada na resistência aumentada a antimicrobianos. Considerando os resultados obtidos, não foi encontrada evidência que relacione a produção de matriz com formação de biomassa de biofilme e um aumento da resistência. A capacidade de produzir e libertar toxinas extracelulares pela P. aeruginosa é frequentemente relacionada com níveis mais elevados de patogenicidade que podem conduzir a graves consequências e ainda à morte do hospedeiro. Entre estas toxinas extracelulares foram estudadas as produções de hemolisina e piocianina. Cada estirpe de P. aeruginosa estudada demonstrou uma diferente expressão destes factores de virulência. A variação fenotípica é um mecanismo adaptativo muito comum utilizado pela P. aeruginosa para aumentar a sua diversidade e ultrapassar a exposição a condições de stress e mudanças ambientais. Como a variação da morfologia de colónias é a característica da variação fenotípica mais visível, foram observadas colónias formadas por células planctónicas e de biofilme com o objectivo de estabelecer se há uma correlação entre o modo de crescimento bacteriano e variação da morfologia de colónias e, até, resistência associada a biofilmes. Foi observado que, de facto, a variação fenotípica ocorria quando as estirpes de P. aeruginosa cresciam em biofilme. Relativamente à resistência associada a biofilmes, foi registado o aparecimento de pequenas colónias (small-colony variants) em algumas estirpes de P. aeruginosa (PAO1, ATCC 10145, CECT 111, PA14, PAI1 e PAI3), um morfotipo usualmente relacionado com a resistência associada a biofilmes. No entanto, não foi encontrada a relação entre o aparecimento destes morfotipos com a resistência associada a biofilmes e são necessários estudos adicionais para melhor entender e estabelecer a relação entre a resistência associada a biofilmes e estes morfotipos. Este trabalho contribuiu para uma melhor compreensão das características dos biofilmes formados pela P. aeruginosa, incluindo resistência, expressão de factores de virulência e variação fenotípica. Foi concluído que não existe um perfil de biofilme da P. aeruginosa universal. Apesar dos perfis de resistência e susceptibilidade contra a ciprofloxacina e a colistina, respectivamente, terem sido muito idênticos entre todas as estirpes, todos os factores de virulência avaliados demonstraram ser características variáveis entre todas as estirpes estudadas. Para além disso, não foi verificada uma correlação directa entre todos os factores de virulência estudados. Devido à variabilidade encontrada na expressão dos diferentes factores de virulência estudados, nenhuma estirpe foi considerada mais virulenta do que outra. Em adição, os resultados demonstram que há uma necessidade urgente de rever as directrizes clínicas actuais. Estas directrizes devem ter em conta a variação fenotípica, a resposta intrínseca dos biofilmes e os factores de virulência expressos pelos biofilmes de P. aeruginosa, características que têm maior impacto a nível terapêutico.