Fluorescent photolabile protecting groups based on O and N heterocycles

Abstract

The choice of specific protecting groups remains of crucial importance in the success of many steps of organic synthesis and manipulation of polyfunctional molecules, since they prevent the formation of undesired side products and reactions. The use of light of appropriate wavelength can liberate in a spatial and temporal controlled release, synthetic or biologically relevant molecules from its light-sensitive conjugated inactive precursor, covalently bonded to the functional group. These photoremovable protecting groups (PPGs), known as phototriggers or cages in biochemistry, have been widely applied in recent years, as an alternative to classical acid- and base-labile protecting groups, including in phosphates, thiols, amines, alcohols and carboxylic acids. The use of fluorescent photolabile protecting groups allows the visualization, quantification, and the follow-up of spatial distribution, localization, and depletion of the active compound through the monitoring of its fluorescent caged precursor using fluorescence techniques. This broad range of applications supports the development of new photolabile groups with enhanced properties to be suitable for biological purposes, such as large molar extinction coefficients and high photolysis efficiency above 350 nm, which will allow fast cleavage and release of the corresponding functionality and the use of longer wavelengths to minimise side reactions or cell damage. Nevertheless, among the considerable number of light-sensitive groups that have been reported, only few cleave in a practical time by irradiation at wavelengths longer than 400 nm. As part of our research on the design, synthesis and evaluation of new fluorescent (hetero)aromatics, different fluorescent skeletons, such as nitrobenzyl, naphtho-oxazoles, acridines, benzocoumarins as well as their thionated, oxazole- and julolidine-fused analogues, were synthesized, to provide a new contribution to the collection of photoremovable protecting groups. Their application as photosensitive groups for the protection of the carboxylic acid function was studied with amino acids, such as valine and phenylalanine; the neurotransmitter amino acids, glycine, alanine, glutamic acid, β-alanine and γ-aminobutyric acid, as well as with the short chain fatty acid, butyric acid, as model molecules, by coupling through ester bonds to the carboxylic acid terminal. The behaviour of these conjugates was evaluated under different photolysis conditions, namely the wavelength of irradiation and the solvent system (mixtures of organic solvents and aqueous buffer solutions) in a photochemical reactor equipped with lamps of 254, 300 and 350 nm. Given the nature of the bioactive molecules under study and considering the prospective photorelease of this type of compounds in biological media, it is desirable that the photocleavage occurs in short irradiation times at such a wavelength that is compatible with the media to minimize potential side effects. As a result, cleavage with lamps of 419 nm was tested for those conjugates that had short irradiation times at 350 nm. A cleavage kinetic study was undertaken, by monitoring the irradiated reaction mixture by high performance liquid chromatography (HPLC) with UV spectrophotometry detection. In some cases the monitoring was also done by 1H NMR spectroscopy. For some compounds, time-resolved fluorescence measurements were made to elucidate the dynamics of the photolysis process and determine the decay kinetics. The characterization of all new synthesized compounds was made by the usual spectroscopic techniques (UV/vis absorption, FT-IR and 1H and 13C NMR) and analytical techniques (mass spectrometry). Considering the fluorescence properties of the obtained compounds, the fluorescence emission parameters (wavelength of maximum emission, relative fluorescence quantum yield and Stokes´s shift) were also determined.

A escolha criteriosa de grupos protetores reveste-se de enorme importância no sucesso da síntese orgânica envolvendo vários passos, bem como na manipulação de moléculas polifuncionais, uma vez que previnem a formação de muitos produtos e reações secundárias indesejáveis O uso de radiação com o comprimento de onda adequado permite a libertação controlada espacial e temporal de moléculas sintéticas e biológicas relevantes, a partir dos respetivos precursores inativos, covalentemente ligados e sensíveis à luz. Estes grupos protetores fotocliváveis, conhecidos como “phototriggers” ou “cages” em bioquímica, têm sido amplamente aplicados nos últimos anos em alternativa aos grupos protetores clássicos cliváveis por ação de ácidos ou bases, na proteção de fosfatos, tióis, aminas, álcoois e ácidos carboxílicos. Além disso, o facto dos grupos protetores fotocliváveis serem fluorescentes, permite a visualização, quantificação e localização do composto ativo, através da monitorização da distribuição espacial e desaparecimento do precursor por técnicas de fluorescência. Esta vasta gama de aplicações impulsiona o desenvolvimento de novos grupos fotolábeis com propriedades melhoradas para fins biológicos, designadamente possuindo coeficientes de extinção molar e eficiência de fotólise acima dos 350 nm elevados. Estas características possibilitam a clivagem e libertação rápida do composto ativo em comprimentos de onda mais elevados, menos prejudiciais para as células e minimizam possíveis reações secundárias. No entanto, entre o vasto número de grupos fotossensíveis que têm surgido, apenas um número reduzido clivam com tempos de irradiação praticáveis a comprimentos de onda superiores a 400 nm. Atendendo aos interesses de investigação da equipa em que este trabalho se inseriu e que incluem o design, a síntese e avaliação de novos compostos (hetero)aromáticos, foram sintetizadas diversas estruturas fluorescentes derivadas de nafto-oxazole, acridina, benzocumarina e respetivos tionados, bem como análogos de anéis fundidos de benzocumarinas com oxazole e julolidina, de modo a contribuir para o aumento da diversidade de grupos protetores fotocliváveis disponíveis. A sua aplicação como grupos fotossensíveis para a proteção da função ácido carboxílico foi estudada usando os aminoácidos valina e fenilalanina, os neurotransmissores glicina, alanina, ácido glutâmico, β-alanina e o ácido γ-amino butírico, bem como o ácido butírico, como representante de ácidos carboxílicos de cadeia curta, por acoplamento através de uma ligação éster ao terminal ácido carboxílico. Foi avaliado o comportamento destes conjugados face a diferentes condições de fotólise, nomeadamente o comprimento de onda de irradiação e sistemas de solvente (mistura de solventes orgânicos e soluções tampão aquosas), num reator fotoquímico equipado com lâmpadas de comprimento de onda de 254, 300 e 350 nm. Dada a natureza das moléculas bioativas em estudo e de forma a considerar possíveis aplicações de fotolibertação em meio biológico, é desejável que a fotoclivagem ocorra com tempos de irradiação curtos a um comprimento de onda que seja compatível com o meio para minimizar potenciais efeitos indesejáveis. Dessa forma, testou-se a clivagem ao comprimento de onda de 419 nm, para os conjugados com tempos de irradiação curtos a 350 nm. Foi realizado o estudo cinético da fotoclivagem por monitorização da mistura reacional irradiada por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) com deteção espetrofotométrica na zona do UV. Em alguns casos, foi também realizada a monitorização através de espetroscopia de RMN de 1H. Para alguns compostos foram efetuadas medições de fluorescência resolvidas no tempo para melhor elucidar o processo de fotólise e determinar a cinética de decaimento. Foi feita a caraterização de todos os compostos novos sintetizados, pelas técnicas espetroscópicas usuais (absorção no UV/vis, IV e RMN de 1H e 13C) e por técnicas analíticas (espetrometria de massa). Dadas as propriedades de fluorescência dos compostos obtidos, foram também determinados os parâmetros de emissão de fluorescência (comprimentos de onda de emissão máxima, rendimento quântico relativo de fluorescência e desvio de Stokes).