Characterization of the yeast microbiome associated with fruit and vegetable biowastes by culture-dependent and metagenomic methods

Abstract

O estudo da diversidade microbiana na natureza, em particular em ambientes complexos, bem como a procura de novos produtores de compostos de valor acrescentado tem aumentado muito nos últimos anos. No entanto, existe pouca informação sobre a biodiversidade em restos agroalimentares, em particular no que respeita a leveduras. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi o estudo das leveduras associadas a 12 resíduos de frutas e legumes, obtidos da indústria transformadora, através de dois métodos: microbiologia convencional e análise metagenómica. Foram isoladas 607 leveduras ao longo de um processo de fermentação em pequena escala e estas foram identificadas através da técnica de PCRRFLP seguida da sequenciação da região ITS1-5.8S-ITS2. Os 607 isolados correspondem a 22 géneros (7 géneros no dia 0 das fermentações). Para a análise metagenómica foi otimizado um protocolo de extração de DNA de modo a maximizar a recolha do DNA microbiano na presença de grandes concentrações de biomassa vegetal. A sequência parcial da região ITS2 foi analisada por pirosequenciação (454 Life Sciences) e as sequências analisadas através da base de dados SILVA, tendo sido identificados 28 géneros. Através do método convencional predominaram os géneros Candida, Clavispora, Cyberlindnera, Galactomyces, Hanseniaspora, Pichia, Rhodotorula e Wickerhamomyces. Pela análise metagenómica, para além dos géneros referidos, foram também detetados em mais de metade dos resíduos agro-alimentares leveduras dos géneros Kazachstania, Saccharomyces, Torulaspora e Trichosporon. Adicionalmente, uma significativa percentagem de sequências foram apenas identificadas ao nível do reino, do filo ou da família. Deste modo, a combinação dos métodos de microbiologia convencional e metagenómica permite uma visão global da biodiversidade associada a restos de frutas e legumes. Por fim foi avaliado o crescimento das 607 leveduras isoladas dos restos de fruta e legumes em 4 hidrolisados naturais (milho, palha, eucalipto e milho doce). O melhor crescimento foi verificado nos hidrolisados de palha e milho doce, com predominância de isolados do género Candida. Por outro lado, as espécies que melhor cresceram no hidrolisado de eucalipto, não foram apenas do género Candida, mas também outras espécies tais como Pichia kudriavzevii, Wickerhamomyces anomalus. Pichia fermentans, Galactomyces geotrichum, Pichia fermentans e Rhodotorula mucilaginosa. Este último hidrolisado contem concentrações significativas de furfurais e ácido acético. Assim, as estirpes que crescem neste hidrolisado poderão ser boas candidatas para a produção de produtos de valor acrescentado com aplicação biotecnológica.

The study of microbial diversity in nature, particularly in complex environments, and the demand for new producers of valuable bioproducts have been in great focus in the last years. However, little information is available about the microbial diversity of biowastes, in particular in what respects yeasts. For this reason, the objective of this study was to evaluate the yeast microbiome associated with 12 by-products of fruit and vegetable biowastes from transforming industries by two methods: conventional microbiological methods and metagenomic analysis. Six hundred and seven cultivable yeast isolates were recovered during small-scale fermentation and identified based in a PCR-RFLP technique followed by sequencing of ITS1-5.8S-ITS2 region. These isolates corresponded to 22 genera (7 genera in day 0 of fermentation). For metagenomic analysis, a DNA extraction protocol was optimized to maximize the recovery of microbial DNA in the presence of high concentrations of plant biomass. Partial ITS2 sequence was analysed by pyrosequencing (454 Life Sciences) and the sequences identified against the SILVA database, resulting in 28 different genera. The genera that were more predominant in the culture-dependent approach were Candida, Clavispora, Cyberlindnera, Galactomyces, Hanseniaspora, Pichia, Rhodotorula and Wickerhamomyces. In addition, metagenomic approaches revealed the predominance (in more than half of the biowastes) of Candida, Hanseniaspora, Kazachstania, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulaspora, Trichosporon and Wickerhamomyces. In addition, a significant percentage of sequencies were only identified to the kingdom, phylum or family levels. This way, the combination of culturedependent and culture-independent methods generated a general view of fruit and vegetable biowastes microbial ecology. The growth of 607 yeasts isolates in 4 natural hydrolysates (maize, straw, eucalyptus and sweet maize) was evaluated. The best results were achieved in straw and sweet maize hydrolysates, with predominance of Candida species. On the other hand, the best growers in eucalyptus hydrolysate were not only Candida species, but other species such as Pichia kudriavzevii, Wickerhamomyces anomalus. Pichia fermentans, Galactomyces geotrichum, Pichia fermentans and Rhodotorula mucilaginosa. This last hydrolysate contains a significant concentration of furfural and acetic acid. Thus, the strains that are best growers in this hydrolysate might be interesting candidates to be used in biorefining strategies for the production of high-value-added products for biotechnological application.