Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/23003

TitleFlow cytometry as a novel tool for structural and functional characterization of isolated yeast vacuoles
Author(s)Rodrigues, Jorge Miguel Pires
Advisor(s)Côrte-Real, Manuela
Gerós, H.
Issue date2012
Abstract(s)The yeast vacuole is functionally analogous to the mammalian lysosome. Both play important roles in fundamental cellular processes such as protein degradation, detoxification, osmoregulation, autophagy and apoptosis which, when deregulated in humans, can lead to several diseases. Some of these vacuolar roles are difficult to study in a cellular context, and therefore the use of a cell-free system is an important approach to gain further insight into the different molecular mechanisms required for vacuolar function. The aim of this thesis was to develop a set of protocols for the structural and functional characterization of yeast vacuoles isolated from Saccharomyces cerevisiae using flow cytometry and several commercially available fluorescent probes. Flow cytometry analysis was complemented by other fluorescence based thecniques, namely fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. The isolation protocol resulted in a yeast vacuolar fraction with a degree of purity suitable for cytometric analysis. Moreover, isolated vacuoles were structurally and functionally intact, and able to generate and maintain electrochemical gradients of ions across the vacuolar membrane, as assessed by flow cytometry. Proton and calcium gradients were dissipated by NH4Cl and calcimycin, respectively. These results established flow cytometry as a powerful technique for the characterization of isolated vacuoles. The protocols developed in this study can also be used to enhance our understanding of several molecular mechanisms underlying the development of lysosomal-related diseases, as well as of the role of the vacuole/lysosome in different cellular processes such as apoptosis. Moreover they can be used to screen for new drugs that modulate these processes, which have promising clinical relevance.
O vacúolo da célula de levedura é funcionalmente análogo ao lisossoma da célula de mamífero. Ambos desempenham funções importantes em processos celulares fundamentais tais como a degradação de proteínas, destoxificação, osmorregulação, autofagia e apoptose que, quando desregulada em humanos, pode levar a diversas doenças. Alguns destas funções do vacúolo são difíceis de estudar num contexto celular, e portanto a utilização de um sistema não celular é uma estratégia importante para melhor compreender os diferentes mecanismos moleculares subjacentes à função vacuolar. O objectivo desta tese foi desenvolver um conjunto de protocolos para a caracterização estrutural e funcional de vacúolos isolados da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizando a citometria de fluxo e diversas sondas fluorescentes disponíveis comercialmente. A análise por citometria de fluxo foi complementada por outras técnicas de fluorescência, nomeadamente a microscopia de fluorescência e a espectrofluorimetria. O protocolo de isolamento utilizado na levedura permitiu a obtenção de uma fracção vacuolar com um grau de purificação apropriado para a análise citométrica. Adicionalmente, a análise por citometria de fluxo de suspensões de vacúolos isolados demonstrou que estes, após o isolamento, mantinham não só a sua integridade estrutural e funcional intactos, mas também a capacidade de gerar e manter um gradiente electroquímico de iões através da membrana vacuolar. A adição de NH4Cl e calcimicina conduziu respectivamente à dissipação do gradientes de protões e de cálcio. Estes resultados validam a exploração da citometria de fluxo como uma técnica poderosa para a caracterização de vacúolos isolados. Os protocolos desenvolvidos neste estudo podem também ser utilizados para a elucidação de diversos mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento de doenças lisossomais, assim como do papel do vacúolo/lisossoma em diferentes processos celulares tais como a apoptose. Estes protocolos podem ainda ser utilizados para o rastreio de novas drogas que modulam estes processos e que têm relevância clínica promissora.
TypemasterThesis
DescriptionDissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas
URIhttp://hdl.handle.net/1822/23003
AccessopenAccess
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses

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