Development of biomarkers for the identification of pathogenic Candida species

Abstract

In the last decades the incidence of fungal infections has increased exponentially, due to the development of more aggressive therapeutic techniques, which increase the number of immunocompromised and in risk individuals. The Candida species are the most common etiological agents isolated from opportunistic fungal infections in these patients and Candida albicans appears to be the most common species isolated. However, infections caused by nonalbicans species, such as C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis and C. krusei, are increasing alarmingly. It is thought that the susceptibility to antifungal drugs varies according to species, thus, the rapid and correct identification of infecting species are crucial. Microsatellite sequences have been largely used as molecular targets to differentiate and characterize strains. However, no studies have been performed using microsatellite DNA for Candida species identification. Therefore, the main objectives of this work were the evaluation of the potential of microsatellite markers for species differentiation and for identification of specific C. albicans lineages. After an intensive search for described microsatellite markers for the main Candida species, several markers were selected for C. albicans, C, glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis and C. krusei. These markers were combined into a multiplex strategy and this new developed system tested in 81 strains from 10 different species. All tested loci amplified correctly in single and multiplex conditions, except for the C. tropicalis selected locus that was unable to amplify in multiplex. After removal of the C. tropicalis primers, this system showed 100% specificity and 100% sensibility. To test if the microsatellites were able to identify specific C. albicans lineages two microsatellite markers were used, CAI and CAVIII. These markers are located in two repeat-containing ORFs, CAI is located in the terminal-3’ of RLM1 gene and CAVIII in the terminal-3’ of SAP8 gene. CAI microsatellite has been previously described and CAVIII was described for the first time in this study. CAVIII demonstrated to be highly specific for C. albicans strains and presented a discriminatory power of 0.72. The two microsatellite markers were tested in 144 unrelated C. albicans strains isolated from different body locations, allowing the statistical differentiation of strains from oral cavity, vulvovaginal infections and from extra-mucosal (respiratory tract and urine) infections. The number of extra-mucosal strains was increased to 224 and statistical analysis based in CAI genotypes, demonstrated significant differences between genotypes of strains isolated from superficial (oral and vagina) and invasive infections (respiratory tract, urine and blood). The results obtained allowed to conclude that the microsatellite loci analysis can be used to differentiate the most common Candida species, being an alternative in clinical diagnosis. Moreover, it was also possible observe that analysis of repeat containing ORFs, such as RLM1 and SAP8 is able to differentiate lineages of C. albicans.

Nas ultimas décadas a incidência das infecções provocadas por fungos têm aumentado exponencialmente. A principal razão proposta para esta mudança incide no desenvolvimento de métodos terapêuticos mais agressivos, responsáveis pelo aumento do número de indivíduos imunocomprometidos. As espécies de Candida são os agentes etiológicos mais frequentemente isolados de amostras de pacientes com infeções fúngicas oportunistas, sendo Candida albicans a espécie mais comum. Contudo, as infecções provocadas por outras espécies, nomeadamente C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei, têm aumentado em grande escala. Sabe-se que a susceptibilidade ás terapêuticas antifúngicas varia de acordo com a espécie causadora da infecção, assim, a correta identificação destes organismos é essencial. As sequências de DNA microssatélite têm sido frequentemente utilizadas como alvos para a diferenciação de estirpes. Contudo, não têm sido realizados estudos que utilizem o DNA microssatélite na identificação das espécies patogénicas de Candida. Desta forma, o principal objectivo deste trabalho consistiu na avaliação do potencial dos marcadores de microssatélites na diferenciação de espécies, assim como na diferenciação de linhagens de C. albicans. Após uma intensa pesquisa por marcadores de microssatélites previamente descritos, cinco marcadores foram selecionados para a identificação de C. albicans, C, glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. krusei. Estes marcadores foram combinados numa reação de PCR-multiplex e o sistema desenvolvido foi testado em 81 estirpes de 10 espécies diferentes. Todos os marcadores apresentaram uma amplificação específica em reação singleplex e multiplex, porém, o marcador selecionado para a identificação de C. tropicalis não foi capaz de amplificar em reação de multiplex. Após remover o marcador para a C. tropicalis do sistema de identificação foi obtida uma especificidade e sensibilidade de 100%. Com o objectivo de verificar a utilidade da análise do DNA microssatélite na diferenciação de linhagens de C. albicans foram utilizados dois marcadores, CAI e CAVIII, localizados no terminal 3’ das regiões codificantes dos genes RLM1 e SAP8, respectivamente. O primeiro, CAI, já tinha sido previamente descrito apresentando elevada estabilidade e especificidade, enquanto que o CAVIII foi descrito pela primeira vez neste trabalho. O microssatélite CAVIII demonstrou ter elevada especificidade para as estirpes de C. albicans e apresentou um poder discriminatório de 0.72. Ambos os microssatélites foram testados utilizando 144 estirpes de C. albicans isoladas a partir de diferentes locais, e a análise combinada dos genótipos obtidos com os dois microssatélites permitiram diferenciar as estirpes provenientes da cavidade oral, de infecções vulvovaginais e de infeções invasivas. Porém, o número de estirpes provenientes de infecções invasivas foi aumentado numa fase posterior do estudo, e a análise estatística foi realizada novamente utilizando apenas os genótipos obtidos com o marcador CAI. Esta análise demonstrou diferenças significativas entre as estirpes provenientes das infecções superficiais e estirpes provenientes das infecções invasivas, demonstrando a sua utilidade na diferenciação das linhagens de C. albicans. Os resultados obtidos permitiram concluir que a análise de DNA microssatélite pode ser útil para diferenciar as espécies de Candida mais comuns, sendo uma excelente alternativa para o diagnóstico clínico. Para além disso, é também possível observar que a análise combinada com os marcadores CAI e CAVIII permite a diferenciação de linhagens de C. albicans.