Characterization of the mycoflora and the occurrence of mycotoxins in Portuguese maize

Abstract

The reduction of yield, quality, and nutritional value of grain cereals by filamentous fungi and subsequent contamination with mycotoxins is of great concern around the world. Mycotoxins are known to cause serious health problems in animals and some mycotoxins such as aflatoxins, fumonisins and ochratoxins, in particular, have also been associated with human health problems. Aflatoxins, fumonisins and ochratoxin A produced by several Aspergillus species are prominent among the mycotoxins associated to maize economic losses (Zea mays L.). However, the presence of a given fungus does not mean that the mycotoxin(s) associated with that fungus is (are) also present. There are many factors, especially environmental conditions and agricultural practices, involved in the production of mycotoxins. The aim of this thesis was to contribute to the risk assessment of post-harvested contamination of maize kernels with aflatoxins (AFs), cyclopiazonic acid (CPA), fumonisins B1 and B2 (FB1 and FB2, respectively) and ochratoxin A (OTA) in three Portuguese regions (Beira Litoral, Ribatejo e Alto Alentejo). To this end, studies were made, first to determine maize Aspergillus mycoflora and assess the mycotoxigenic potential of the isolated strains, and secondly to determine the incidence of AFs, CPA, OTA and FB in milled maize. Ninety five maize samples were collected between November 2008 and April 2009 in maize association of producer’s facilities in three different agroclimatic regions of Portugal. These samples were taken at reception, after drying and after storage, and moisture content was measured immediately after sampling. Strains of Aspergillus were isolated and identified through phenotypic characterization and mycotoxin production. Molecular work was also done in eight isolates that could not be fully identified, up to species level, and a new species belonging to Aspergillus section Flavi was described and named as Aspergillus mottae Around ninety one percent of the maize samples were contaminated with strains of Aspergillus. These were subsequently grouped into five sections: Flavi (423 isolates) followed by Nigri (270 isolates), Wentii (214 isolates), Circumdati (15 isolates) and Candidus (2 isolates). The fungal frequency of the isolations obtained from the samples belonging to the three steps of the maize storage chain differs. The highest frequency occurs after drying, being the lowest frequency at reception followed by storage. What concerns Aspergillus species isolations at each region, the regions with Mediterranean climates had a higher percentage of Aspergillus section Nigri isolates in comparison with the region with transitional between Atlantic and Mediterranean climate. Maize samples were analyzed by HPLC for mycotoxin contamination. Mycotoxins were detected in 83% of the samples, with prevalence for FB1. Hence, 83% percent of the samples were positive for FB1, 46% were positive for FB2 and only 5% were positive for AFs. None of the samples were positive for OTA and CPA. In conclusion, the two Producer’s Society and the Agricultural Cooperative showed to have good practices, minimizing the occurrence of mycotoxins. Even though Aspergillus section Flavi, especially of A. flavus, and Aspergillus section Nigri isolates were present in high numbers in the maize kernels, very few samples were contaminated with aflatoxins (5%), and none were positive for either CPA and OTA. The presence of fumonisins (FB1 and FB2) in the majority of the samples (83 and 46%, respectively) suggests that there was pre-harvest contamination with Fusarium species. There is no evidence that the presence of FB2 is due to the presence of Aspergillus niger aggregate isolates.

A redução do rendimento, qualidade e valor nutricional dos cereais por fungos filamentosos e consequente contaminação com micotoxinas é de grande preocupação em todo o mundo. As micotoxinas são conhecidos por causar sérios problemas de saúde nos animais e algumas micotoxinas em particular as aflatoxinas, fumonisinas e ocratoxinas, também têm sido associadas a problemas de saúde nos seres humanos. As aflatoxinas, fumonisinas e ocratoxina A, produzidas por várias espécies de Aspergillus, estão entre as micotoxinas associadas a perdas económicas no milho (Zea mays L.). No entanto, a presença de um dado fungo não significa que a(s) micotoxina(s) associada também esteja(m) presente. Há muitos factores envolvidos na produção de micotoxinas, tendo especial relevância as condições ambientais e as práticas agrícolas. O objectivo desta tese foi contribuir para a avaliação do risco de contaminação póscolheita de grãos de milho com aflatoxinas (AFs), ácido ciclopiazónico (CPA), fumonisinas B1 e B2 (FB1 e FB2, respectivamente) e de ocratoxina A (OTA), em três regiões portuguesas (Beira Litoral, Ribatejo e Alto Alentejo). Para este fim, foram realizados estudos com o intuito de determinar, em primeiro lugar, a variedade de Aspergillus associada ao milho e o potencial micotoxigénico das estirpes isoladas, e, em segundo lugar, determinar a incidência de AFs, CPA, OTA e FB em farinha de milho. De modo a atingir os objectivos, foram recolhidas noventa e cinco amostras de milho entre Novembro de 2008 e Abril de 2009 em Associações de Produtores de milho situadas em três regiões de Portugal com diferenças agroclimáticas. Estas amostras foram retiradas na recepção, após a secagem e após o armazenamento, tendo sido medido o teor de humidade logo após a amostragem. As estirpes de Aspergillus foram isoladas e identificadas através da caracterização fenotípica e da produção de micotoxinas. Foram realizados estudos moleculares em oito isolamentos, uma vez que não puderam ser identificados até ao nível de espécie. O resultado deste trabalho permitiu descrever uma nova espécie pertencente aos Aspergillus secção Flavi, cuja designação passou a ser Aspergillus mottae. À volta de de 91% das amostras de milho estavam contaminadas com estirpes de Aspergillus. As estirpes foram identificadas como pertencentes a cinco diferentes secções: Flavi (423 isolamentos), seguida por Nigri (270 isolamentos), Wentii (214 isolamentos), Circumdati (15 isolamentos) e Candidus (2 isolamentos). A frequência fúngica entre os isolamentos obtidos a partir das amostras pertencentes às três etapas da cadeia de armazenamento de milho difere. A maior frequência ocorre após a secagem, sendo a menor frequência na recepção seguida do armazenamento. No que refere a isolamentos de espécies de Aspergillus em cada região, as regiões com climas Mediterrânicos apresentaram maior percentagem de isolamentos de Aspergillus secção Nigri em comparação com a região de clima de transição entre Atlântico e Mediterrânico. As amostras de milho recolhidas foram analisadas por HPLC para determinar se estariam contaminadas com micotoxinas. As micotoxinas foram detectadas em 83% das amostras, com prevalência para FB1. Assim, 83% por cento das amostras foram positivas para FB1, 46% foram positivas para FB2 e apenas 5% foram positivas para AFs. Nenhuma das amostras acusou a presença de OTA e CPA. Em conclusão, as Associações de Produtores mostraram ter boas práticas, minimizando a ocorrência de micotoxinas. Mesmo que a presença de estirpes de Aspergillus secção Flavi, principalmente de A. flavus, e de estirpes de Aspergillus secção Nigri estivessem presentes em números elevados nos grãos de milho, poucas amostras mostraram estar contaminadas com aflatoxinas (5%), e nenhum delas foi positiva quer para CPA quer para OTA. A presença de fumonisinas (FB1 e FB2) na maioria das amostras (83 e 46%, respectivamente) sugere que houve uma contaminação pré-colheita com espécies de Fusarium. Não há nenhuma prova que indique que a presença de FB2 é devido à presença de estirpes pertencentes ao agregado Aspergillus niger