Physiological characterization of Ashbya gossypii and strain development for recombinant protein production

Abstract

Ashbya gossypii is a phytopathogenic hemiascomycete belonging to the Saccharomycetaceae family. This fungus has attracted attention because of its natural ability to produce riboflavin (vitamin B2) as a detoxifying and protective mechanism being used at an industrial level as a biotechnological important producer of riboflavin. The genome sequence of this filamentous fungus revealed remarkable similarities to that of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae both at the level of homology and synteny. A. gossypii is a very promising experimental system because it has a small genome (the smallest eukaryotic genome known to date) and haploid nuclei. Moreover, efficient gene targeting due to the high homologous recombination efficiency in A. gossypii makes it possible to do one-step gene replacement by PCR-based gene targeting. A. gossypii also allows extrachromosomal free replication of plasmids bearing an autonomous replicator. Taking advantage of these unique features, the overhall purpose of this project was to explore the potential of A. gossypii as an alternative cell factory organism. As little information was available for this organism, the project began with the physiological characterization of different A. gossypii strains. Also, the information in the literature regarding its secretory ability was inexistent and thus two heterologous proteins were used to evaluate this feature. In addition, different strategies were undertaken to improve its secretion ability and a global transcriptome analysis was conducted to identify the bottlenecks on A. gossypii secretory pathway. Colony radial growth rates and specific growth rates of three related A. gossypii strains ATCC10895, IMI31268, MUCL29450 and an unrelated strain, CBS109.26, were measured on various carbon and nitrogen sources at pH 4.5 and pH 6.5 to elucidate physiological growth requirements and strain differences. All strains grew on yeast extract or ammonium as nitrogen sources, but not on nitrate. Substantial growth at pH 4.5 was observed only on complex medium. D-Glucose, glycerol and starch were utilised as carbon sources. Ethanol was produced during growth on glycerol. Conversion of xylose into xylitol demonstrates that the xylose reductase is active. Phenotypic differences between related strains were greater than expected. It was shown that A. gossypii utilizes ammonium as sole nitrogen source at pH 6.5, facilitating further physiological studies using chemically defined media in the future. Even though filamentous fungi are excellent producers of a broad spectrum of extracellular enzymes such as amylases, proteases and catalases, little is known about the secretory capacity of A. gossypii. To explore the potential of A. gossypii as a host for the expression of recombinant proteins and to assess whether protein secretion would be more similar to the closely related S. cerevisiae or to other filamentous fungi, endoglucanase I (EGI) and cellobiohydrolase I (CBHI) from the fungus Trichoderma reesei were successfully expressed in A. gossypii from plasmids containing the two micron sequences from S. cerevisiae. The native signal sequences of EGI and CBHI were able to direct the secretion of EGI and CBHI into the culture medium in A. gossypii. Although CBHI activity was not detected using 4-methylumbelliferyl--D-lactoside as substrate, the protein was detected by Western blot using monoclonal antibodies. EGI activity was detectable and the specific activity being comparable to that produced by a similar EGI producing S. cerevisiae construct. More EGI was secreted than CBHI, or more active protein was produced. Partial characterization of CBHI and EGI expressed in A. gossypii revealed overglycosylation when compared with the native T. reesei proteins, but the glycosylation was less extensive than on cellulases expressed in S. cerevisiae. In order to improve the general secretion ability, A. gossypii was subject to random mutagenesis with ethyl methane sulfonate (EMS). Selection and screening was carried out in order to identify secretion mutants with improved protein secretion ability. Secreted EGI, amylase and beta glucosidase activities of the parental strain and five key mutants were investigated and used as an indicator for enhanced protein production after the mutagenic treatment. Mutagenesis improved EGI and amylase activity in the culture supernatant of the mutants S436 and S466 by 2 and 3-fold increase respectively, compared to the initial parental strain. At the same time, the mutant S436 also revealed 40% improvement in the beta glucosidase activity. Mutant S397 showed a 2 fold increase in beta glucosidase activity. Overall, mutant S436 seems to be the most promising A. gossypii strain since all the activities tested were enhanced when comparing to the parental strain. This means that the general secretion capacity of this mutant was enhanced. Another attempt to improve the secretion capacity of A. gossypii relied on the deletion of GAS1 gene, which codes for a -1,3-glucanosyltransglycosylase involved in cell wall assembly. GAS1 gene is present as a tandem repeat in A. gossypii genome. With this approach, a higher permeability of the cell wall was expected and hence an increase in the protein secretion capacity. However two scenarios where observed. The individual deletion of one copy of the gene severely impaired growth whereas the abolishment of the other copy resulted in similar amounts of EGI secreted into the extracellular medium when compared to the initial recombinant strain. As a result this strategy failed to enhance A. gossypii secretory capacity. In order to understand and determine the limitations encountered along A. gossypii secretory pathway, a transcriptomic analysis was carried out in the recombinant EGI producing strain and also under chemical induced stress by dithiotreitol (DTT). Surprisingly, none of the conditions tested were able to induce unfolded protein response (UPR) in A. gossypii. EGI production can be expected to have such an effect since the production levels are very low to cause ER stress. However, the translation machinery was down regulated under EGI producing conditions, which can explain the low EGI production levels. Neither DTT, a widely used UPR inducer was able to activate UPR in A. gossypii. Instead endoplasmatic reticulum associated degradation (ERAD) was highly induced when the mycelium was treated with DTT. The lack of a strong UPR response when low levels of an heterologous protein is being produced, or during chemically induced stress, strongly suggests that non-UPR mediated bottlenecks might exist in A. gossypii that hamper efficient secretion.

Ashbya gossypii é uma hemiascomicete pertencente á família Saccharomycetaceae. Este fungo tem atraído atenção devido à capacidade de produzir riboflavina (vitamina B2) naturalmente como um mecanismo de destoxificação e de defesa. Sendo considerado um produtor de riboflavina biotecnologicamente importante e como tal, tem sido usado a nível industrial. A sequência genómica deste fungo filamentoso revelou semelhanças extraordinárias com a levedura Saccharomyces cerevisiae quer ao nível da homologia quer da sintenia. Este fungo é um sistema experimental muito promissor porque possui um genoma pequeno (o genoma eucariota mais pequeno conhecido até á data) e núcleos haplóides. Para além disso, a elevada eficiência de recombinação permite a deleção de genes de modo eficiente, sendo possível de ser feito num único passo por técnicas de PCR dirigidas. A. gossypii também permite a replicação livre extracromossomal de plasmídeos que possuam um replicador autónomo. Tomando partido destas vantagens únicas, o objetivo geral deste projeto consistiu na avaliação do potencial de A. gossypii como uma fábrica celular alternativa. Como havia pouca informação acerca deste organismo, o projeto começou com a caracterização fisiológica de diferentes estirpes de A. gossypii. A informação relativa à sua capacidade de secreção era inexistente e portanto, duas proteínas heterólogas foram usadas para avaliar esta capacidade. Para além disso, várias estratégias foram implementadas com o objetivo de melhorar a sua capacidade de secreção e uma análise de transcriptoma foi efetuada para identificar os passos limitantes da via de secreção. Foram determinadas as taxas de crescimento radial de colónia e taxas específicas de crescimento em várias fontes de carbono e de azoto a pH 4.5 e pH 6.5 de três espécies de A. gossypii similares, nomeadamente, ATCC10895, IMI31268, MUCL29450 e de uma espécie mais afastada, CBS 109.26, de modo a elucidar os requisitos fisiológicos de crescimento e as diferenças entre as espécies. Todas as estirpes cresceram em extrato de levedura ou amónio como fonte de azoto, mas não em nitrato. Foi observado crescimento substancial a pH 4.5 apenas em meio complexo. D-glucose, glicerol e amido foram utilizados como fonte de carbono. Durante o crescimento em glicerol, detetou-se produção de etanol. A conversão de xilose em xilitol demonstrou que a xilose redutase está ativa. Diferenças fenotípicas entre as estirpes mais semelhantes foram maiores do que o esperado. Foi mostrado que o A. gossypii utiliza amónio como fonte de azoto a pH 6.5, facilitando estudos fisiológicos que no futuro usem meio definido. Embora os fungos filamentosos sejam excelentes produtores de uma vasta gama de enzimas extracelulares, tais como amilase, protease e catalase, pouco se sabe acerca da capacidade secretória de A. gossypii. Com o objetivo de explorar o potencial de A. gossypii como um organismo usado para a expressão de proteínas recombinantes e de modo a avaliar se a secreção de proteínas será mais semelhante à S. cerevisiae ou a outros fungos filamentoso, a endoglucanase I (EGI) e a celobiohidrolase I (CBHI) do fungo Trichoderma reesei, foram expressas com sucesso em A. gossypii a partir de plasmídeos que contêm a sequência 2 micra de S. cerevisiae sob o promotor PGK1 de S. cerevisiae. A sequência sinal nativa da EGI e da CBHI direcionou a secreção da EGI e da CBHI para o meio de cultura em A. gossypii. Embora a atividade da CBHI não tenha sido detetada com o substrato 4- methylumbelliferyl--D-lactoside, a proteína foi detectada por Western blot realizado com anticorpos monoclonais. A actividade da EGI foi detetada, sendo que a atividade específica é comparável à de uma estirpe de S. cerevisiae produtora de EGI. Mais EGI foi secretada em comparação com CBHI ou foi produzida proteína mais ativa. A caracterização parcial da CBHI e da EGI produzidas em A. gossypii revelou hiperglicosilação quando comparada com as proteínas nativas de T. reesei, mas a glicosilação foi menos extensa do que nas celulases expressas em S. cerevisiae. De modo a melhorar a capacidade geral de secreção, A. gossypii foi sujeito a mutagénese aleatória com etil metano sulfonato (EMS). A seleção e o rastreio foram realizados com a finalidade de identificar mutantes com uma capacidade melhorada de secretar proteínas. Foram medidas as atividades das enzimas secretadas, EGI, amilase e beta glucosidaes da estirpe parental e de cinco mutantes chave e usadas como um indicador de aumento de produção de proteínas após o tratamento mutagénico. A mutagénese resultou num aumento de 2 e 3 vezes na atividade da EGI e da amilase no sobrenadante da cultura dos mutantes S436 e S466, comparado com a estirpe parental. Simultaneamente, o mutante S436 também revelou um aumento na atividade de beta glucosidase. O mutante mutante S397 apresentou um aumento de 2 vezes na atividade da beta glucosidase. No geral, o mutante S436 parece ser a estirpe de A. gossypii mais promissora uma vez que todas as atividades medidas sofreram um aumento quando comparadas com a estirpe parental. Isto significa que a capacidade geral de secreção deste mutante foi melhorada. Uma outra tentativa para melhorar a capacidade de secreção do A. gossypii baseou-se na deleção do gene GAS1, que codifica para uma -1,3-glucanosyltransglycosylase envolvida na montagem da parede celular. No genoma de A. gossypii existem duas cópias do gene GAS1. Com esta abordagem esperava-se um aumento na permeabilidade da parede celular e consequentemente um aumento na capacidade de secreção de proteínas. Contudo, foram observados dois cenários. A deleção individual de uma cópia do gene afetou gravemente o crescimento, ao passo que a eliminação da outra cópia resultou em quantidades semelhantes de EGI secretadas para o meio extracelular, quando comparado com a estirpe recombinante inicial. Como resultado, esta estratégia falhou no aumento da capacidade secretora de A. gossypii. De modo a compreender e a determinar as limitações encontradas ao longo da via de secreção de A. gossypii, foi realizada uma análise de transcriptoma na estirpe recombinante produtora de EGI e também sob stress quimicamente induzido por ditiotreitol (DTT). Surpreendentemente, nenhuma das condições testadas foi capaz de induzir a “Unfolded protein response” (UPR) em A. gossypii. Seria de esperar tal efeito por parte da EGI, tendo em conta os baixos níveis de expressão. Contudo, a maquinaria de tradução foi reprimida nas condições de produção de EGI, o que por sua vez ajuda a explicar os baixos níveis de produção de EGI. Nem mesmo o DTT, um indutor de UPR amplamente utilizado, foi capaz de ativar a UPR em A. gossypii. Em vez disso, a degradação associada ao reticulo endoplasmático (ERAD) foi altamente induzida quando o micélio foi tratado com DTT. A ausência de uma resposta UPR forte quando uma proteína heteróloga está a ser produzida a baixos níveis ou durante stress quimicamente induzido, sugere que limitações não relacionadas com a UPR possam existir em A. gossypii e que estejam a condicionar uma secreção eficiente.