Proteomic and phenotypic view of Pseudomonas aeruginosa resistance due to antimicrobial stress

Abstract

Several studies have recognised that bacteria present higher resistance to antimicrobials when switching from planktonic to biofilm mode of life. However, the phenotypic and proteomic changes associated with the reduced susceptibility of biofilms to antimicrobials are still poorly described. The goal of this work was to extend the understanding about the biofilm-augmented tolerance of Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen that exhibits intrinsic resistance to several antimicrobial agents, and shows great aptitude to acquire adaptive resistance to environmental pressures. The experimental analysis was two-fold: a phenotypical examination comprising the initial adhesion ability, biofilm formation and susceptibility to antimicrobial agents, and a proteomic characterisation of the outer membrane (OM) proteins in planktonic and biofilm modes of growth. In order to best reproduce real-world situations and explore cell adaptive resistance, the study covered several P. aeruginosa strains, namely: a reference strain (ATCC 10145), an endoscope surface isolate, four clinical isolates inherently exposed to real pressures, and a laboratory-adapted strain obtained in vitro by sequential exposure to increasing concentrations of benzalkonium chloride (BC). As biofilms can comprise more than one species, and the interactions between microorganisms can enhance biofilm survival and resistance, Escherichia coli was used to form mixed biofilms. The phenotypical examination accounted for susceptibility to the BC and antibiotics Ciprofloxacin (CIP) and Gentamicin (GM) whilst the proteome of the OM of BC-adapted P. aeruginosa was characterised in planktonic and biofilm modes of growth. Motility has been pinpointed as an important factor for P. aeruginosa adhesion and biofilm development, this trait being also associated with increased microorganism virulence. Each P. aeruginosa clinical isolate revealed specific ability to develop biofilm and to move along a surface, as well as specific biofilm response to the presence of BC and CIP. However, it was not possible to clearly establish direct relationships between higher motility and biofilm formation ability and increased resistance. The variability of behaviour observed between the clinical isolates has called attention to the need to develop and adopt standardized operational procedures to evaluate biofilm formation capacity, as well as its sensitivity to in-use antimicrobials. Bacteria aptitude to become dormant when exposed to antimicrobial agents was also characterized as a possible mechanism of virulence. Biofilms formed by the endoscope-isolated P. aeruginosa were exposed to intermittent cycles of high-doses of CIP and GM to assess the so-called post-antibiotic effect. At the end of each stress cycle, the remaining cells were able to regrowth and reconstitute the biofilm, achieving values of the same magnitude of those obtained when biofilms were developed in the absence of antibiotics. So, it is conceivable to think that biofilm-growing P. aeruginosa strains possess high capacity to survive to external antibiotic pressure. Indeed, it is believed that such pressure acts as a selector of persister cells that are able to recolonize the surface contributing to increased biofilm recalcitrance. The effect of antimicrobials on P. aeruginosa early-adhesion was detailed by studying the impact of BC residue deposition on the adhesion surfaces, as well as on the bacteria surface properties. Results showed that the presence of BC alters the thermodynamic properties of bacteria and adhesion surfaces, favouring adhesion and promoting biofilm formation. So, to prevent bacterial outbreaks and disinfection practice failures, special care should be taken with the design of effective sanitation programs avoiding antimicrobial residues accumulation. The existence within a biofilm of multiple bacterial species can assist interspecies relationships, which might stimulate biofilm development and increase stability, and thus augment resistance. Studies with P. aeruginosa and E. coli showed that the continuous exposure of biofilms to sub-lethal concentrations of BC induced an adaptive response of both bacteria, stimulating biofilm formation and the overproduction of a denser and cohesive matrix. Data emphasised that the use of inappropriate doses of antimicrobials can, instead of kill sessile microorganisms and remove them from the surfaces, lead to the development of biofilms encompassing more virulent bacteria. Resistance mechanisms are often related with changes in membrane permeability and differential expression of efflux-pumps and porins. The proteomic analysis of the outer membrane (membranome) of BC-adapted P. aeruginosa revealed differences in the expression of a small number of proteins after planktonic adaptive selection. Results suggest that planktonic bacterial adaptation does not mobilize transport systems at membranome level. Biofilm proteomic studies revealed that adaptation to BC and CIP promotes the downregulation of several proteins, suggesting a shared resistance response of P. aeruginosa to the action of both antimicrobials. The differentially expressed proteins are related to: pilus formation (type IV pilus biogenesis), which affects motility and adhesion; membrane vesicle production (putative tail sheath protein and bacteriophage protein), which is known to contain active toxins and other virulence factors; and unknown function (major capsid protein), encoded by genes belonging to the genomic island PAGI-6, a prophage that has undergone multiple recombination and deletion events resulting in altered virulence. The different expression of these proteins may be on the basis of the emergence of small colony variants or sticky strains in biofilms, the increased P. aeruginosa virulence emphasised by higher adhesion, hydrophobicity, swimming and twitching motilities and also biofilm ability to survive under chemical stress conditions. This work contributed significantly to the phenotypic and proteomic understanding of P. aeruginosa biofilm tolerance. It was concluded that resistance is strain-dependent and in close association with the surrounding environmental stresses. Moreover, the exposure to environmental stressors dictated P. aeruginosa recalcitrance and enhancement of bacteria virulence factors. This knowledge will undoubtedly assist the development of new and more effective strategies to control biofilm formation and treatment regimens to eradicate biofilm-growing bacteria.

Nos últimos anos, vários estudos têm demonstrado que as bactérias quando crescidas na forma de biofilme apresentam uma resistência antimicrobiana superior à observada em crescimento planctónico. Contudo, as alterações fenotípicas e proteómicas associadas à diminuição de susceptibilidade aos produtos antimicrobianos das bactérias quando constituídas em biofilme ainda não estão completamente caracterizadas e descritas. Neste cenário, este trabalho teve como objectivo contribuir para o conhecimento acerca do aumento da tolerância aos produtos antimicrobianos oferecida pelos biofilmes formados por Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria patogénica que apresenta frequentemente elevada resistência intrínseca a agentes antimicrobianos e grande aptidão para adquirir resistência adaptativa em resposta a pressões ambientais externas. De modo a compreender o comportamento de bactérias em biofilmes, quando expostos a pressões ambientais, e obter informação acerca dos mecanismos que podem estar na base da tolerância aumentada dos biofilmes, procedeu-se à caracterização fenotípica e proteómica de biofilmes de P. aeruginosa expostos a diferentes produtos antimicrobianos. Com o intuito de melhor reproduzir situações reais e explorar a resistência adaptativa exibida por bactérias, este trabalho incluiu várias estirpes de P. aeruginosa: uma de referência (ATCC 10145), uma isolada de um endoscópio, quatro isolados clínicos inerentemente expostos a pressões reais, e uma estirpe adaptada em laboratório por exposição sequencial a concentrações crescentes de cloreto de benzalcónio (BC). Uma vez que, naturalmente, os biofilmes podem ser compostos por mais do que uma espécie de microrganismo e que a interação entre eles pode favorecer a capacidade de sobrevivência e a tolerância a produtos antimicrobianos, uma estirpe de Escherichia coli foi também estudada de modo a desenvolver biofilmes mistos. A caracterização fenotípica envolveu, a determinação da susceptibilidade a BC e aos antibióticos, ciprofloxacina (CIP) e gentamicina (GM), enquanto que a análise proteómica compreendeu a caracterização das proteínas da membrana externa de bactérias de P. aeruginosa adaptadas a CB em crescimento planctónico e em biofilme. Um factor importante associado ao aumento da virulência de P. aeruginosa, com grande influência na adesão e formação de biofilme é a capacidade de locomoção ou motilidade. Cada isolado clínico de P. aeruginosa estudado revelou especificidade na sua capacidade de desenvolver biofilmes e de se mover à superfície, bem como na resposta dos biofilmes à presença de BC e CIP. Contudo, não foi possível estabelecer uma relação evidente direta entre a maior capacidade de locomoção, formação de biofilme, e aumento de resistência. A variabilidade de comportamentos observada alertou para a necessidade de se desenvolver e adotar procedimentos de operação padronizados para avaliar a capacidade de formação de biofilme, bem como a sua sensibilidade a produtos antimicrobianos de uso comum. Um outro factor de virulência bastante importante é a capacidade de as bactérias se tornarem dormentes quando expostas a produtos antimicrobianos. De modo a estudar esta característica, biofilmes desenvolvidos pela estirpe isolada do endoscópio foram expostos a ciclos intermitentes de elevadas doses de CIP e GM, determinando-se assim o efeito pós-antibiótico. No final de cada ciclo, as bactérias que sobreviveram foram capazes de recrescer e reconstituir o biofilme, alcançando valores da mesma grandeza que os biofilmes desenvolvidos na ausência de antibióticos. Os resultados obtidos permitem especular que bactérias de P. aeruginosa quando crescidas em biofilme apresentam capacidade superior de sobreviver a pressões externas exercidas por antibióticos. Este factor de stress atuou assim como seletor de bactérias persistentes capazes de recolonizar superfícies o que poderá contribuir para o aumento da recalcitrância de biofilmes. De modo a determinar qual a ação de produtos antimicrobianos na adesão inicial de P. aeruginosa e se a presença destes poderá contribuir para o aumento da resistência, foi estudado o impacto da deposição de resíduos de BC nas propriedades das superfícies das bactérias e das superfícies de adesão. Os resultados obtidos mostraram que a presença de BC causa modificações nas propriedades termodinâmicas de ambas as superfícies. Estas alterações favoreceram a adesão, promovendo a formação de biofilme, especialmente da estirpe adaptada a BC. Assim, de modo a prevenir surtos bacterianos e más práticas de desinfecção, devem ser tomadas precauções especiais na definição e implementação de procedimentos de limpeza eficientes, evitando a deposição de resíduos de produtos antimicrobianos. A presença de múltiplas espécies de microrganismos na população que constitui o biofilme pode favorecer a relação entre as espécies, que poderá promover o desenvolvimento do biofilmes e aumentar a sua estabilidade, desenvolvendo assim a sua resistência. Os estudos efectuados com biofilmes mistos de P. aeruginosa e E. coli mostraram que a exposição contínua a concentrações sub letais de BC induziu uma resposta adaptativa dos biofilmes. Esta adaptação provocou um aumento da capacidade de formação de biofilme, e a elevada produção e coesão da matriz polimérica. Os dados obtidos enfatizaram que o uso de doses inapropriadas de produtos antimicrobianos poderá, em vez de inativar os microrganismos e eliminálos das superfícies, promover o desenvolvimento de biofilmes constituídos por bactérias mais virulentas. Os mecanismos de resistência estão frequentemente associados a alterações da permeabilidade da membrana e expressão diferencial de proteínas de bombas de efluxo e porinas. Assim, de modo a compreender se a estirpe adaptada a BC apresenta alterações a nível proteico, vários estudos proteómicos foram efectuados. A análise proteómica das proteínas da membrana (membranoma) de bactérias de P. aeruginosa adaptadas a BC em crescimento planctónico revelou diferenças na expressão de um reduzido número de proteínas após seleção por adaptação. Os resultados obtidos sugerem que a adaptação bacteriana a BC em estado planctónico não parece mobilizar sistemas de transporte ao nível da membrana externa. Os perfis proteicos das bactérias de P. aeruginosa adaptadas em biofilme mostraram que, a adaptação a BC e a CIP causou a subexpressão de algumas proteínas. A expressão comum poderá indicar uma possível resposta semelhante da bactéria quando exposta a ambos os produtos. As proteínas diferencialmente expressas estão relacionadas com: formação de pili (“type IV pilus biogenesis”) afecta a motilidade e adesão, ii) produção de vesículas da membrana (“putative tail sheath protein” e “bacteriophage protein”), codificadas por genes que fazem parte de uma ilha genómica (PAGI-6), um profago que sofreu eventos de recombinação e deleção, causando alterações de virulência. A diferente expressão de proteínas de tal importância, poderá estar na base da emergência de variantes de colónias pequenas ou mucoides em biofilmes, aumentando assim a expressão de factores de virulência de P. aeruginosa tais como adesão, hidrofobicidade, capacidade de locomoção e a capacidade de sobrevivência de biofilmes em condições de stress químico. Os dados obtidos ao longo deste trabalho contribuíram para a compreensão fenotípica e proteómica da tolerância de P. aeruginosa quando constituída em biofilme. A resistência está dependente da estirpe e em estreita relação com o ambiente externo e a exposição a estes factores externos de stress poderá interferir com a recalcitrância da bactéria P. aeruginosa e aumento dos seus factores de virulência. A compreensão de tais alterações permitirá o desenvolvimento de novas e mais eficientes técnicas de controlo da formação de biofilme e dos procedimentos para erradicar bactérias associadas em biofilme.