In vitro models for cartilage engineering using primary cells and biodegradable scaffolds

Abstract

Cartilage tissue engineering investigation has been developing strongly in the last years. The main difficulty in cartilage regeneration is its restricted self-repair capacity. Thus, investigation has been focused in promoting the regeneration of functional tissues. There are already products in the market using tissue engineering concepts to promote cartilage regeneration. The results of these treatments, although positive, still need improvements. Current treatments with joint implants are not long lasting and frequently require revision. Tissue engineering thus may provide different solutions based on tissues repair, contrarily to substitution by joint implants. This thesis comprises the investigation of three in vitro models aiming to produce cartilage extracellular matrix (ECM), using primary cultures and scaffolds as supports for cell growth and ECM deposition. The scaffold is one of the key points in a tissue engineering strategy, thus several morphologies and formulations based on biodegradable scaffolds were explored herein. Moreover, different culture conditions were also investigated, either by using dynamic cultures (stirred and flow perfusion) or static cultures. Therefore, the thesis is divided in 3 sections concerning each of the in vitro models tested and cells used: bovine articular chondrocytes (BAC), human bone marrow derived mesenchymal stem cells (hBMSCs), and co-cultures of human primary culture of articular chondrocytes (hACs) and MSCs. The first studies of this thesis were developed with BACs using two types of electrospun scaffolds: polycaprolactone (PCL) and starch compounded with PCL (SPCL) nanofiber meshes and microporous scaffolds. Those were composed by a blend of chitosan-poly(butylene succinate) (CPBS) with two different pore sizes and morphologies. Overall, we concluded that BAC model allowed the production of cartilage ECM on all tested scaffolds. For electrospun nanofiber meshes, no significant differences were found between PCL and SPCL as supports for the cells in terms of ECM deposition. However, results were positive in terms of the matrix deposition in both substrates. Concerning CPBS scaffolds, 80 CPBS formulation presenting larger pores with random distribution proved to have a stronger performance when compared to 60 CPBS formulation. Those results showed the importance of larger pores for cells to colonize the scaffolds structure and deposit ECM. In our second model we studied the chondrogenic differentiation of hBMSCs when cultured onto nanofibers (PCL) or chitosan-based microfiber meshes, using an in house developed flow perfusion bioreactor. Human MSCs were able to grow and differentiate when cultured either seeded in electrospun nanofiber meshes or in microfiber meshes. The use of dynamic culture with nanofiber meshes did not provide solid evidences of an enhancement of hBMSCs chondrogenic differentiation. Conversely, microfiber meshes indeed showed being adequate for this type of culture, as chondrogenic differentiation was enhanced when hBMSCs were seeded and cultured on those scaffolds in the bioreactor, compared to the static control. The results may even be further enhanced by the optimization of the flow rate used in those experiments. Finally, co-cultures using hACs and hMSCs seeded onto chitosan-based microfiber meshes were established. We selected two different sources of hMSCs (hBMSCs or human Wharton´s jelly mesenchymal stem cells - hWJSCs) and compared their chondrogenic potential when co-cultured in direct contact with hACs, or indirectly cocultured with conditioned medium derived from hACs cultures. Results showed that indirect co-cultures using conditioned medium promoted more cartilage ECM formation, both with hBMSCs or with hWJSCs. Additionally, hWJSCs demonstrated a higher chondrogenic potential than hBMSCs that produced an ECM containing higher expression levels of collagen type I. This result is very interesting because it is believed that has a higher potential to be used in clinic to treat patients, since unrelated chondrocytes may be used to induce the chondrogenic differentiation of autologous adult stem cells. Overall, the work on this thesis presents some valid concepts for cartilage tissue engineering. We were able to obtain cartilage like tissue using primary cultures, either differentiated or undifferentiated. Deposition of cartilage ECM was observed in all the tested 3D biodegradable scaffolds either in static or in dynamic culture conditions. The advantages of co-culturing differentiated and undifferentiated cells for cartilage engineering were also demonstrated.

A investigação em engenharia de cartilagem teve um desenvolvimento muito intenso nos últimos anos. Uma das maiores dificuldades em regenerar cartilagem prende-se com o facto de este tecido ter uma capacidade de auto-regeneração muito limitada. Actualmente, já existem no mercado alguns produtos para a regeneração de tecido cartilagíneo, baseados em conceitos de engenharia de tecidos. Apesar de trazerem resultados positivos, estes tratamentos ainda necessitam de ser muito optimizados. A aplicação actual de implantes para recuperar a funcionalidade das articulações não é duradoura, e frequentement os implantes necessitam de revisão após alguns anos. A engenharia de tecidos pode desenvolver soluções mais duradouras, baseadas na regeneração de tecidos e não na substituição da área afectada por implantes articulares. Esta tese engloba o estudo de três modelos in vitro desenvolvidos com o objectivo de produzir matriz extracelular de cartilagem (ECM), utilizando culturas celulares primárias e “scaffolds” como suportes para o crescimento das células e deposição da referida matriz. O “scaffold” é um dos aspectos críticos numa estratégia de engenharia de tecidos, por isso vários “scaffolds” biodegradáveis com morfologias e formulações diferentes foram avaliados. Várias condições de cultura foram também investigadas, usando culturas dinâmicas (agitação ou fluxo de perfusão) ou estáticas. Consequentemente, a tese está dividida em três secções correspondentes a cada um dos modelos in vitro testados, e agrupados segundo o tipo de células utilizadas: condrócitos articulares bovinos (BAC), células estaminais mesenquimais derivadas de medula óssea (hBMSCs) e co-culturas de células primárias humanas: condrócitos articulares (hACs) e células estaminais mesenquimais (hMSCs). Os primeiros estudos apresentados nesta tese foram desenvolvidos com BACs e dois tipos de malhas de nanofibras: nanofibras de policaprolactona (PCL) ou de amido composto com policaprolactona (SPCL), e também com um “scaffold” com microporosidade. Estes últimos “scaffolds” foram produzidos com uma mistura de quitosano e de polibutileno succinato (CPBS), apresentando dois tamanhos de poros características e morfologias diferentes. Em geral, concluimos que o modelo com BACs permitiu a produção de ECM em todos os “scaffolds” e malhas de nanofibras testados. Não foram observadas diferenças significativas em termos de deposição de ECM entre as malhas de PCL e de SPCL. No entanto, os resultados foram considerados positivos, pois houve deposição de ECM em ambos os substratos. No que diz respeito aos “scaffolds” de CPBS, a formulação 80 CPBS (com poros maiores de distribuídos aleatoriamente) demonstrou um desempenho biológico mais expressivo quando comparada com a formulação 60 CPBS. Estes resultados mostraram a importância de poros de maior tamanho na estrutura dos “scaffolds” para facilitar a colonização celular e a deposição de ECM. O segundo modelo explorado é referente ao estudo da diferenciação condrogénica de hBMSCs cultivadas em malhas de nanofibras (PCL) ou de microfibras (formadas por misturas de quitosano), usando para tal um bioreactor de perfusão desenvolvido pelo nosso grupo. Observou-se crescimento e diferenciação das células cultivadas quer nas malhas de nanofibras, quer nas malhas de microfibras. A cultura dinâmica não evidenciou facilitar a diferenciação condrogénica das hBMSCs. Por outro lado, foi demonstrado que as malhas de microfibras são adequadas para este tipo de culturas dinâmicas, pois a diferenciação condrogénica foi potenciada nas culturas destes “scaffolds” no bioreactor, comparativamente com os controlos estáticos. Estes resultados poderão ainda vir a ser melhorados através da optimização das condições de fluxo de meio de cultura utilizadas nestas experiências. Finalmente, realizaram-se co-culturas de hACs e hMSCs em malhas de microfibras. Foram seleccionados dois tipos de hMSCs: hBMSCs ou células estaminais mesenquimais derivadas da geleia de Wharton (hWJSCs). Comparou-se o potencial condrogénico dos dois tipos de células estaminais quando co-cultivadas em contacto directo com hACs, ou em contacto indirecto, usando para tal meio condicionado proveniente das culturas de hACs. Os resultados demonstraram que as culturas indirectas com meio condicionado promoveram uma maior formação de ECM, usando quer hBMSCs, quer hWJSCs. Adicionalmente, as hWJSCs revelaram um potencial condrogénico mais elevado do que as hBMSCs, que produziram uma ECM rica em colagénio tipo I. O resultado com os meios condicionados é muito interessante porque consideramos que poderá ter um elevado potencial para futuras aplicações clínicas. A utilização de condrócitos heterólogos para obtenção de meios condicionados que promovam a diferenciação condrogénica de células estaminais autólogas parece-nos importante no contexto da engenharia de tecidos da cartilagem. O trabalho apresentado nesta tese revelou alguns conceitos válidos para a engenharia de cartilagem. Obteve-se tecido cartilagíneo usando quer culturas primárias de células diferenciadas, quer de células indiferenciadas. A deposição de ECM ocorreu em todos os “scaffolds” 3D biodegradáveis testados, quer em condições estáticas, quer em condições dinâmicas. Por fim, demonstraram-se também algumas vantagens relativas à utilização de coculturas de células diferenciadas com células indiferenciadas para a engenharia de tecidos de cartilagem.