Protein matrices for wound dressings

Abstract

Fibrous proteins such as silk fibroin (SF), keratin (K) and elastin (EL) are able to mimic the extracellular matrix (ECM) that allows their recognition under physiological conditions. The impressive mechanical properties, the environmental stability, in combination with their biocompatibility and control of morphology, provide an important basis to use these proteins in biomedical applications like protein-based wound dressings. Along time the concept of wound dressings has changed from the traditional dressings such as honey or natural fibres, used just to protect the wound from external factors, to the interactive dressings of the present. Wounds can be classified in acute that heal in the expected time frame, and chronic, which fail to heal because the orderly sequence of events is disrupted at one or more stages of the healing process. Moreover, chronic wound exudates contain high levels of tissue destructive proteolytic enzymes such as human neutrophil elastase (HNE) that need to be controlled for a proper healing. The aim of this work is to exploit the self-assemble properties of silk fibroin, keratin and elastin for the development of new protein materials to be used as wound dressings: i) evaluation of the blending effect on the physical and chemical properties of the materials; ii) development of materials with different morphologies; iii) assessment of the cytocompatibility of the protein matrices; iv) ultimately, study the ability of the developed protein matrices as wound dressings through the use of human chronic wound exudate; v) use of innovative short peptide sequences that allow to target the control of high levels of HNE found on chronic wounds. Chapter III reports the preparation of silk fibroin/keratin (SF/K) blend films by solvent casting evaporation. Two solvent systems, aqueous and acidic, were used for the preparation of films from fibroin and keratin extracted from the respective silk and wool fibres. The effect of solvent system used was studied by evaluating the physical-chemical properties of the resulting films. It was shown that SF and K are able to establish intermolecular interactions when mixed and, that the mechanical properties and the biological degradation can be tuned by the blend composition. In Chapter IV, SF/K films were further used to serve as a platform for the release of HNE inhibitors peptides. Bowman-Birk inhibitor (BBI) based peptide was incorporated onto the SF/K films that were consequently incubated with porcine pancreatic elastase (PPE) as a model for HNE, to monitor the decrease in activity. The results indicated that swelling properties, degradation and release rates are dependent on the amount of keratin present in the blend. Furthermore, no cytotoxicity was observed in the presence of mouse fibroblasts, which makes these SF/K films suitable candidates for interactive wound dressings with a specific goal – controlling high levels of HNE. The next step of the work, Chapter V, reports for the first time blends of silk fibroin with elastin (SF/EL) for the production of scaffolds. These were prepared by lyophilization technique and crosslinked with a natural and low toxic agent, genipin. The crosslink allows the control of the scaffolds morphology, such as pore size and porosity, which in turns, modulates the ex vivo degradation rates, by a human chronic wound exudate, and the release rates of model compounds. In addition, no cytotoxicity was observed for SF/EL samples, with and without genipin, by human skin fibroblasts. Thus, the high porosity observed for SF/EL scaffolds, allowing the growth and cellular attachment, together with their biocompatibility provide fitting characteristics for wound dressings. Chapter VI, describes the design of two elastase inhibitors peptides based on the reactive site-loop of the BBI protein in order to control the high levels HNE. To a known peptide sequence, modifications were made at both N- and C-terminal. Inhibition kinetics analysis indicated that these peptides are competitive inhibitors for HNE and PPE and, that the inhibitory potency can be regulated by the introduced modifications. Additionally, these peptides showed no toxicity with human skin fibroblasts and, were also effective in reducing the HNE activity found in a human chronic wound exudate, which allow them to be applied to those wounds. The motivation for this thesis was to combine the excellent properties of silk fibroin with other proteins. Blending allows modulating the physical-chemical properties of the resulting materials such as mechanical strength, swelling, morphology, degradation and release rates. Silk fibroin is widely characterized in the literature for the production of biomaterials, but this work is the first that successfully evaluates the blends silk fibroin/keratin (SF/K) and silk fibroin/elastin (SF/EL) for their application as wound dressings.

Proteínas fibrosas como a fibroína da seda, a queratina e a elastina têm a vantagem de conseguir imitar a matriz extracelular, permitindo o seu reconhecimento em condições fisiológicas. As excelentes propriedades mecânicas destas proteínas, a estabilidade química juntamente com a biocompatibilidade e controlo da morfologia, são importantes pressupostos para o uso destas proteínas em aplicações biomédicas. Um exemplo é o tratamento de feridas com compressas baseadas nestas proteínas. As compressas usadas nas feridas sofreram grandes mudanças ao longo do tempo, partindo das tradicionais baseadas em mel e fibras naturais, que eram usadas apenas para cobrir e proteger as feridas de factores externos, até às compressas interactivas do presente. As feridas podem ser classificadas em agudas, que curam no tempo previsto e crónicas, que não cicatrizam porque o processo de cura é interrompido. Estas feridas podem ainda ser diferenciadas pelo tipo de exudado que produzem. Nas feridas crónicas, o exudado contém níveis elevados de enzimas proteolíticas como a elastase humana dos neutrófilos (HNE) e as metaloproteases de matriz (MMP), que precisam de ser controlados para um melhor processo de cicatrização. O objectivo deste trabalho é explorar as excelentes propriedades da fibroína, queratina e elastina para o desenvolvimento de novos materiais proteícos para serem usados como compressas. Para tal estudou-se: i) avaliação do efeito das misturas nas propriedades físicas e químicas dos materiais; ii) desenvolvimento de materiais com diferentes morfologias; iii) avaliação da toxicidade dos materiais; iv) avaliação das propriedades dos materiais desenvolvidos usando um exudado obtido de feridas crónicas; v) desenvolvimento de péptidos inibidores para controlar os elevados níveis de HNE nas feridas crónicas. No Capítulo III é descrita a preparação de membranas baseadas na mistura fibroína e queratina (SF/K) por evaporação de solvente. Foram utilizados dois sistemas de solventes, aquoso e ácido, para a preparação dos filmes a partir da fibroína e queratina extraídas das respectivas fibras têxteis, seda e lã. Estudou-se o efeito dos solventes usados nas propriedades físico-químicas das membranas resultantes. Verificou-se que a fibroína e a queratina estabelecem interacções intermoleculares e, as propriedades mecânicas e a degradação podem ser moldadas através da composição da mistura. No Capítulo IV, as membranas desenvolvidas foram posteriormente utilizadas para a libertação de inibidores da elastase. Péptidos baseados na proteína inibidora Bowman- Birk (BBI) foram incorporados nas membranas de fibroína e queratina verificando-se que após incubação com a elastase há uma diminuição da actividade da mesma. Os resultados demonstram que as propriedades de inchamento, degradação e libertação dependem da quantidade de queratina presente na mistura. Adicionalmente, os materiais não apresentam toxicidade na presença de fibroblastos de ratinho. Os resultados indicam que estas membranas são candidatas adequados para o uso em compressas interactivas com uma actividade específica – controlar os elevados níveis de HNE. O próximo passo do trabalho, Capítulo V, reporta pela primeira vez, o desenvolvimento de estruturas esponjosas baseadas na mistura de fibroína e elastina (SF/EL). Estes materiais foram preparados por liofilização e fixados com um agente de fixação natural e de baixa toxicidade, a genipina. Este passo de fixação permite controlar a morfologia dos materiais como o tamanho dos poros e porosidade, que têm influência directa na degradação pelo exudado e na libertação de compostos modelo. Observou-se também, que as estruturas esponjosas não apresentam toxicidade para fibroblastos humanos de pele, mesmo depois da fixação com genipina. Consequentemente, a biocompatibilidade demonstrada juntamente com a porosidade observada nestes materiais, que permitem a adesão e crescimento de células, são características importantes para o uso destes em compressas para feridas. O Capítulo VI descreve o desenvolvimento de dois péptidos inibidores da elastase baseados no centro activo da proteína BBI de forma a controlar os elevados níveis de HNE presentes nas feridas crónicas. Foram introduzidas modificações nos terminais C e N de uma sequência conhecida. Estudos cinéticos de inibição indicam que estes péptidos são inibidores competitivos para a elastase de diferentes fontes, humana e porcina, e que a capacidade inibitória depende das modificações introduzidas. Adicionalmente, os péptidos não são tóxicos na presença de fibroblastos humanos de pele sendo eficazes na redução da actividade da elastase presente num exudado de uma ferida crónica. Estes resultados indicam que os péptidos desenvolvidos podem ser usados no tratamento das mesmas. A motivação deste trabalho partiu das excelentes propriedades da fibroína, queratina e elastina. O desenvolvimento de novos materiais baseados em misturas destas proteínas permite moldar as propriedades finais como a força mecânica, inchamento, morfologia, degradação e libertação de compostos. O uso da fibroína em biomateriais está vastamente descrito na literatura. Contudo, este trabalho descreve pela primeira vez, com sucesso, o uso das misturas fibroína/queratina e fibroína/elastina para a sua aplicação em compressas para feridas.