Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/10773

TitleRegulação da autofagia pelo KRAS de modo a compreender o seu papel no cancro humano
Author(s)Alves, Sara Cristina Sequeira
Advisor(s)Preto, Ana
Sousa, Maria João
Issue date21-Dec-2009
Abstract(s)A evasão à morte celular programada (MCP) é uma das características dos cancros humanos. O papel da autofagia no cancro não é bem compreendido. Dependendo do tipo e contexto celulares, a autofagia pode actuar como um mecanismo supressor de tumor, induzindo a MCP, ou como um processo de sobrevivência. A mutação oncogénica KRAS está entre os eventos mais frequentes no carcinoma colorectal (CCR), ocorrendo em cerca de 50% dos tumores, contudo o seu papel na autofagia não está ainda completamente esclarecido. Estudos recentes mostraram que a proteína RAS pode ter efeitos opostos sobre a autofagia; quando activa a PI3K de classe I, a autofagia é inibida, mas quando activa a cascata RAF/ERK 1/2, a autofagia é estimulada. Várias vias de sinalização da levedura Saccharomyces cerevisiae são homólogas às encontradas nos humanos. Por este motivo, S. cerevisiae é um modelo eucariótico simples que tem sido utilizado para compreender os mecanismos básicos envolvidos em diferentes processos celulares, tais como a autofagia. Para avaliar o efeito das mutações do oncogene KRAS na regulação da autofagia no CCR, utilizamos o modelo da levedura S. cerevisiae para a expressão heteróloga da mutação humana KRASG13D e do gene selvagem KRASWT e avaliação dos níveis de autofagia, por monitorização de marcadores autofágicos. Os genes foram inseridos num vector de expressão em leveduras e as construções utilizadas para transformar uma estirpe de S. cerevisiae deficiente no gene RAS2, homólogo dos proto-oncogenes do RAS de mamíferos. Utilizou-se uma estirpe ras2Δ dado que na presença desta proteína não se detectou qualquer efeito do KRAS selvagem ou mutado na indução de autofagia. Adicionalmente, esta estirpe contém uma versão truncada do gene PHO8 (PHO8Δ60) em substituição do gene normal, o que permite a avaliação dos níveis de autofagia por monitorização da actividade da fosfatase alcalina (FAL). A autofagia foi também avaliada por monitorização da quantidade de Atg8p por análise de Western blotting. A mutação humana activante KRASG13D resultou numa indução da autofagia em S. cerevisiae em condições de privação de fonte de azoto. Por outro lado, a presença do gene humano selvagem KRASWT não levou a uma indução da autofagia. Este estudo aponta para a grande complexidade dos papéis do gene RAS na regulação da autofagia e valida a utilização da levedura como um modelo celular alternativo para o esclarecimento deste processo nomeadamente do seu papel no CCR.
Evasion from programmed cell death (PCD) is one of the hallmarks of human cancers. The role of autophagy in human cancer is not well understood. Depending on the cell type and context autophagy may act either as a tumor suppressor mechanism, enhancing PCD or as a survival process. KRAS mutations are among the most frequent events in colorectal carcinoma (CRC) occurring in about 50% of the tumors. So far the role of RAS in autophagy is still elusive. However, a recent study has found that RAS may have opposite effects on autophagy; when it activates Class I PI3K, autophagy is inhibited, but when it activates the RAF /ERK1/2 cascade, autophagy is stimulated. Several signaling pathways of the yeast Saccharomyces cerevisiae are homologous to those found in humans. For this reason, the simple eukaryotic model S. cerevisiae has been used to understand the basic mechanisms involved in different cellular processes such as autophagy. To assess the effect of human KRAS mutations in autophagy regulation, we used the yeast S. cerevisiae cell model for heterologous expression of the human KRASG13D mutation, as well as wild type KRASWT gene and evaluation of levels of autophagy, by monitoring autophagic markers. These genes were cloned into expression plasmids in yeast and these constructs used to transform a S. cerevisiae strain deleted for RAS2, homologous of mammalian RAS protooncogenes. A ras2Δ strain was used since in the presence of the protein no effect of KRASWT or of KRASG13D in autophagy could be detected. Additionally, this strain carries a truncated version of PHO8 (PHO8Δ60) instead of the normal gene, to assess alkaline phosphatase whose activity is used as an indication of autophagic levels. We also assessed autophagy induction by monitoring the amount of Atg8p by Western blot analyses. The human KRASG13D mutation induced a significant increase of autophagy in S. cerevisiae upon nitrogen starvationOn the other hand, the presence of the human KRASWT failed to induce autophagy in the same conditions. In summary, this study points to the complexity of the role of RAS in the regulation of autophagy and validates the use of yeast as a cell model towards the elucidation of this issue, namely in CRC.
TypeMaster thesis
DescriptionTese de mestrado em Genética Molecular
URIhttp://hdl.handle.net/1822/10773
AccessRestricted access (UMinho)
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses

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