The transport of carboxylic acids in yeasts : from physiology towards structural-functional characterization of permeases

Abstract

Plasma membrane proteins occupy a central role in cell biology. They control many important aspects on nutrient transport, intracellular signaling and homeostasis, thus they are subjected to a surprisingly tight regulation, according to different physiological conditions. In this thesis we aimed at studying the physiology, biochemical features and molecular regulation of carboxylic acids plasma membrane transporters, in different yeast species. Homologs to Jen1 monocarboxylate transporter of Saccharomyces cerevisiae have been described in different microorganisms. In the first part of this work we have demonstrated that in Candida albicans a CaJEN1 paralog, CaJEN2, previously assigned by homology as a lactate transporter, encodes a novel dicarboxylate plasma membrane transporter, induced by succinic and malic acids. A strain deleted in both genes lost the ability to transport lactic, malic and succinic acids, by a mediated mechanism and it displayed a growth defect on these substrates. CaJEN2 was heterologously expressed in a S. cerevisiae jen1 strain leading to the detection of a succinate and malate permease activity. Moreover, in in vivo and ex vivo models of infection, it was found that both CaJen1 and CaJen2 are expressed in glucose-poor niches within the host, contributing to carbon metabolism during the early stages of infection. We attempted to identify genes encoding carboxylate permeases in Candida glabrata, the second most prevalent yeast pathogen in humans. Acetic acid-grown cells of C. glabrata ATCC2001 display activity for a mediated mechanism for labelled acetic acid, at pH 5.0, with the following kinetic parameters: Km 8,16 mM and Vmax 8,08 nmol s-1 mg dry wt-1. This yeast experienced a reductive evolution after the WGD, and although it has no predicted homologs of Jen1, it encodes in its genome two putative homologs of ScAdy2, S. cerevisiae acetate transporter. The deletion of the phylogenetically closest ScAdy2 homolog, CAGLOMO3465g, affected the uptake of labelled acetic acid. Nevertheless, wild-type cells and cells disrupted in this gene display similar behaviour, in the distinct growth conditions tested. These results suggest that, besides CAGLOMO3465g, the second ScAdy2 homolog has a putative role in acetic acid transport, in C. glabrata. The heterologous characterization of two predicted ScAdy2 homologs, identified in the acetotrophic methanogen Methanosarcina acetivorans was performed, in an effort to validate their function as acetate transporters. The uptake of labelled acetic acid was followed in S. cerevisiae jen1ady2 strain, transformed with the expression vector ptYEplac181, harboring each one of the ORFS. Nevertheless, no significant differences were encountered between the tested strains. In the second part of the work we studied the regulation of Jen1 and Ady2 expression in S. cerevisiae. JEN1 and ADY2 are subjected to glucose repression and their transcription is induced in cells grown in non-fermentable carbon sources. Formic acid is not used as sole carbon and energy source by S. cerevisiae, however it acts as a non-competitive substrate for Jen1 and as a competitive inhibitor of Ady2. Cells incubated in formic acid do not express the mRNAs of any of the transporter. However, a striking result was found in a strain deleted in the DHH1 gene: the transcripts for both transporters were found in 4h formic acid-induced cells. We demonstrate that Dhh1, a DEAD-box RNA helicase, affects the half-live times of Jen1 and Ady2 mRNAs. Global transcriptional analyses performed in the wild-type and mutant dhh1 strains suggested that other important genes, like the transcription factor encoding CAT8 gene, encountered similar regulation. In the third part of this work, we have studied the mechanisms underlying glucose-induced down-regulation of Jen1 monocarboxylate transporter of S. cerevisiae. By monitoring the Jen1-GFP subcellular localization, protein stability and permease activity, in several mutant strains, we demonstrated that glucose-downregulation of Jen1 is dependent on casein kinase 1 phosphorylation, on the HECT ubiquitin ligase Rsp5 ubiquitylation and on the presence of the arrestin-like adaptor protein, Art4. Furthermore, we have shown that Jen1 is modified at the cell surface by oligoubiquitylation, with ubiquitin-Lys63 linked chains(s), and that Jen1-Lys338 of Jen1 is one of the target residues. Finally, ubiquitin-Lys63 linked chains(s) were revealed to be directly or indirectly involved in the sorting of Jen1 into MVBs, making Jen1 one of the few examples for which it was demonstrated the requirement of ubiquitin- Lys63 linked chains for the correct trafficking at two stages of endocytosis.

As proteínas de membrana plasmática ocupam um lugar central na biologia celular, sendo determinantes no controlo do transporte de nutrientes, da sinalização intracelular e da homeostasia, e por conseguinte, encontram-se sujeitas a uma regulação apertada, de acordo com as alterações fisiológicas. A presente tese teve como objectivo estudar a fisiologia, as características bioquímicas e a regulação molecular dos transportadores de ácidos carboxílicos, em diferentes espécies de leveduras. Recentemente, foram descritos diversos homólogos do transportador de monocarboxilatos de Saccharomyces cerevisiae Jen1, em diferentes microrganismos. Na primeira parte do trabalho, demonstrámos que o parálogo de CaJEN1 de Candida albicans, o gene CaJEN2, anotado por homologia como um transportador de lactato, codifica um transportador de membrana plasmática de dicarboxilatos, sujeito a indução pelos ácidos succínico e málico. Uma estirpe com delecção em ambos os genes perdeu a capacidade de transportar ácido láctico, málico e succínico, através de um mecanismo mediado, apresentando deficiências de crescimento, na presença dos mesmos substratos. A expressão heteróloga de CaJEN2 na estirpe S. cerevisiae jen1 conduziu à detecção da actividade de transporte mediado para succinato e malato. Em modelos in vivo e ex vivo de infecção, CaJen1 e CaJen2 são expressos em nichos pobres em glucose, no interior do hospedeiro, contribuindo dessa forma para o metabolismo de carbono, durante as fases iniciais de infecção. A procura de transportadores de ácidos carboxílicos foi efectuada em Candida glabrata, a segunda levedura patogénica mais prevalente em humanos. Em células de C. glabrata ATCC2001, crescidas em ácido acético, foi caracterizado um sistema de transporte mediado para ácido acético marcado radioactivamente, a pH 5.0, com os seguintes parâmetros cinéticos: Km 8,16 mM and Vmax 8,08 nmol s-1 mg peso seco-1. Esta espécie sofreu uma evolução reductora após o WGD e, embora não possua qualquer homólogo de Jen1, o seu genoma apresenta dois homólogos de ScAdy2. A delecção de CAGLOMO3465g, o homólogo filogeneticamente mais relacionado com ScAdy2, afectou o transporte mediado de ácido acético. Todavia, as células com delecção neste gene apresentaram um comportamento idêntico ao encontrado para a estirpe selvagem, em todas as condições de crescimento testadas. Possivelmente, para além de CAGLOMO3465g, haverá o envolvimento do segundo homólogo de ScAdy2 no transporte de ácido acético em C. glabrata. A expressão heteróloga em S. cerevisiae de dois homólogos de ScAdy2, identificados em Methanosarcina acetivorans, foi efectuada, com o intuito de avaliar a sua função fisiológica, nesta arquea metanogénica acetotrófica. O transporte de ácido acético marcado radioactivamente foi seguido na estirpe S. cerevisiae jen1ady2 transformada com o vector de expressão ptYEplac181, contendo cada uma das ORFs, contudo não foram encontradas diferenças significativas entre as estirpes testadas. Na segunda parte do trabalho estudámos a regulação da expressão de Jen1 e de Ady2 em S. cerevisiae. JEN1 e ADY2 estão sujeitos a repressão pela glucose e a sua transcrição é induzida em células crescidas em fontes de carbono não-fermentescíveis. O ácido fórmico não é utilizado como fonte de carbono e energia por S. cerevisiae, actuando contudo, como um inibidor não-competitivo de Jen1 e como um inibidor competitivo de Ady2. Células induzidas em ácido fórmico não expressam os mRNAs de nenhum dos transportadores. Todavia, um resultado surpreendente foi obtido numa estirpe com delecção no gene DHH1: os transcritos de ambos os transportadores foram encontrados em células induzidas em ácido fórmico, durante 4h. Foi ainda demonstrado que a proteína Dhh1, uma DEAD-box RNA helicase, afecta os tempos de meia-vida dos mRNAs de Jen1 e Ady2. Análises de expressão global, efectuadas nas estirpes selvagem e mutante, sugerem que outros genes importantes, nomeadamente o CAT8, gene codificador de um factor de transcrição, sofrem uma regulação semelhante. Finalmente, estudámos os mecanismos subjacentes à repressão do transportador de monocarboxilatos em S. cerevisiae, Jen1 por glucose. Através da monitorização da localização subcelular de Jen1-GFP, da sua estabilidade e da sua actividade, demonstrámos que a inactivação de Jen1 promovida por glucose é dependente da fosforilação, efectuada pela caseína cinase 1, da ubiquitilação promovida pela ubiquitina ligase Rsp5 e da presença do adaptador tipo-arrestina, Art4. Adicionalmente, demonstrámos que a permease Jen1 é modificada na superfície da célula por oligoubiquitilação com cadeia(s) de ubiquitina ligadas pela Lis63, e que Jen1-Lis338 de Jen1 é um dos resíduos alvo. Finalmente, cadeia(s) ubiquitin Lis63 encontram-se, directa ou indirectamente, relacionadas com o direccionamento do Jen1 para os MVBs, tornando o Jen1 um dos poucos exemplos onde se demonstrou que as cadeia(s) Ub-Lis63 são necessárias para o tráfego correcto em dois passos da endocitose.