The unique biology of RNA-protein granules in brain pathologies

Abstract

A proteína tau é crucial em algumas doenças neurodegenerativas, tal como na doença de Alzheimer (DA). Avanços recentes no campo das doenças neurodegenerativas têm indicado que o stress crónico e altos níveis de glucocorticoides podem desregular a homeostasia do metabolismo do RNA levando à formação de grânulos de stress (GS), que quando persistentes atuam como nucleadores para a agregação de outras proteínas, como Tau. Além disso, a DA e a Síndrome de Down (SD) partilham muitas características neurológicas e neuropatológicas, mas muito pouco se sabe sobre a relevância destas vias para a neurodegeneração da SD e a toxicidade sináptica. Neste projeto, pretendemos caracterizar o tráfego intraneuronal de proteínas ligadas ao RNA (RBPs) e a formação de GSs na SD, entendendo melhor os mecanismos associados à patologia da Tau e à formação de SG; e esclarecer a importância do mTOR e da autofagia para a limpeza de Tau e GSs induzidos por stress crónico em patologias Tau. Assim, tratamos animais P301L-Tg e WT com CCI-779, um inibidor de mTOR, ou veículo, em paralelo ao protocolo de stress crónico imprevisível (CUS), seguido de análise comportamental e molecular. O stress crónico induziu um fenótipo de ansiedade em P301L-Tg, com o CCI-779 atuando como ansiolítico e mostrando eficiência no bloqueio da sinalização mTOR e na indução de autofagia. A análise proteómica de hipocampos de P301L-Tg mostrou diferentes efeitos tanto do stress crónico como do CCI-779 na autofagia, metabolismo do RNA e proteínas sinápticas. Além disso, utilizamos culturas neuronais primárias de animais P301L-Tg e WT cruzadas com linhagens de animais LC3-GFP, para dissecar mecanismos autofágicos. Os resultados indicam que a indução de autofagia com CCI-779, altera o nível de fosforilação da proteína Tau induzida por altos níveis de glucocorticoides in vitro. Paralelamente, caracterizamos Tau e diferentes RBPs no hipocampo de um modelo animais de DS. Observamos uma desregulação dos níveis e localização de RBPs, como PABP, G3BP e FUS, e também alterações na insolubilidade de RBPs, bem como confirmamos níveis aumentados de Tau em DS por WB. O nosso trabalho indica que o mTOR é crucial para os efeitos neurodegenerativos causados pelo stress, e sua modulação pode reverter marcadores importantes, como acúmulo de Tau, RBPs e degeneração sináptica. Além disso, este trabalho contribuiu para a primeira caracterização de diferentes RBPs e acumulação de Tau na SD, o que poderá posteriormente contribuir para uma melhor compreensão da patologia cerebral da síndrome de Down.

Tau protein is crucial in some neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease (AD). Recent advances in the field of neurodegenerative disorders have indicated that chronic stress and high levels of glucocorticoids can deregulate the homeostasis of RNA metabolism leading to the formation of stress granules (SGs), that when persistent act as nucleators for the aggregation of other proteins, like Tau. Furthermore, AD and Down Syndrome (DS) share many neurological and neuropathological characteristics, but very little is known about the relevance of these pathways for DS neurodegeneration and synaptic toxicity. In this project, we aimed to characterize RBPs intraneuronal trafficking and SG assembly in DS, further understand the mechanisms associated with Tau-induced pathology and SG formation and clarify the relevance of mTOR and autophagy for the clearance of both Tau and SG induced by chronic stress in Tau pathologies. Thus, we treated P301L-Tg mice and WT littermates with CCI-779, an inhibitor of mTOR, or vehicle, in parallel to chronic unpredictable stress protocol, followed by behavioural and molecular analysis. Chronic stress-induced an anxiety phenotype in P301L-Tg mice, with CCI-779 acting as an anxiolytic. While the drug showed efficiency in blocking mTOR signalling and autophagy induction, measured by WB and qRT-PCR analysis, we did a proteomic analysis of hippocampi of P301L-Tg mice and observed different effects of both chronic stress and CCI-779 in autophagy, RNA metabolism and synaptic proteins. Additionally, we used in vitro primary neuronal cultures from P301L-Tg and WT littermates crossed with LC3-GFP animal lines, to dissect autophagic mechanisms. The results indicate an induction of autophagy, through the treatment with CCI-779 changes the levels of stress-induced Tau phosphorylation in vitro. In parallel, we characterized Tau and different RBPs in the hippocampus of DS mice. Through immunofluorescence, we were able to see a dysregulation of the RBPS staining and localization, such as PABP, G3BP and FUS, and clarified changes in RBPs insolubility, as well as confirmed increased Tau levels in DS mice by immunoblotting. Our work indicates, that mTOR is crucial for stress-driven neurodegenerative effects, and its modulation can revert important markers, like Tau accumulation, RBPs, and synaptic degeneration. Furthermore, this work contributed to the first characterization of different RBPs and Tau accumulation in DS, which can later contribute to a better understanding of DS brain pathology.