Staphylococcus epidermidis adhesion and biofilm formation onto biomaterials

Abstract

Staphylococcus epidermidis is a coagulase-negative Staphylococcus (CNS) that often colonizes the skin and mucous membranes of the human body, as part of its normal microflora. However, when a rupture of the cutaneous surface occurs, by any type of trauma or insertion of a medical device, staphylococci can enter the host and become pathogenic. Therefore, S. epidermidis has emerged in recent years as a major nosocomial pathogen associated with infections of implanted medical devices, namely prosthetic heart valves and joints, central venous catheters, urinary catheters, contact lenses and hip prostheses. Staphylococci adhere to such devices and have the ability to develop biofilms, which constitutes an important virulence factor and the most relevant pathogenic mechanism of staphylococcal infection. The work described in this thesis aimed at evaluating the adhesion and biofilm formation capabilities of several S. epidermidis strains to biomaterials normally used in the manufacture of indwelling medical devices. The study of the surface properties that affect initial bacterial adhesion as well as of ways to prevent it was also one of the goals of this work. Another objective was to study the properties of a mature biofilm and the phenotypic differences between sessile and planktonic cells. The profiles of cell wall and extracellular matrix proteins were also assessed to evaluate the importance of these proteins on the process of adhesion and biofilm formation. In order to try to correlate the adhesion ability of S. epidermidis strains studied with surface properties of substrata (acrylic and silicone) and cells, hydrophobicity and surface tension components were determined through contact angle measurements. Surface roughness of substrata was also assessed by atomic force microscopy (AFM). An expedite method to reduce S. epidermidis adhesion to acrylic and silicone by heparin and gentian violet surface pre-conditioning was developed. Specific modifications on a polycarbonate surface by gold coating and the subsequent coverage with different self-assembled monolayers (SAMs) were also assayed. Adhesion was performed during two hours and the number of adhered cells was determined by direct enumeration using epifluorescence microscopy. Concerning biofilm formation on acrylic, the total biomass was quantified by crystal violet staining; the number of cells within the biofilm was determined by colony forming units plating; and the extracellular matrix was extracted by the Dowex resin method. The polysaccharides and proteins content of the matrix was also quantified. These results were correlated with the cellular metabolic activity determined by XTT reduction assay and glucose uptake. Metabolic activity of planktonic cells was as well assessed by both methods. Protein profiles of cell wall and extracellular matrix of S. epidermidis strains under study were analysed by SDS-PAGE. Considering cell surface properties (surface tension parameters, degree of hydrophobicity), there were no significant differences among the strains assayed, except for strain IE214. No relationship was found between cell surface hydrophobicity and adhesion capability. However, all strains adhered at a higher extent to silicone, more hydrophobic and rougher than acrylic, indicating that substrata surface properties play a role in initial bacterial adhesion. Both heparin and gentian violet demonstrated to be effective in reducing bacterial adhesion as well as gold covered polycarbonate and methyl terminated SAMs. Thus, these studies have clinical significance, since they point out alternative strategies to the diminishment and prevention of bacterial colonization to biomaterial surfaces. The analysis of the biofilm formation capability and its composition among S. epidermidis strains lead to the confirmation that biofilm formation as well as the production of extracellular polymers are strain dependent and are virulence factors associated to pathogenicity of some S. epidermidis clinical strains. Cell wall and extracellular matrix proteins that are related to the adhesion and biofilm formation processes seem to be present in the proteins patterns analysed, which are potential virulence factors that should be taken into consideration as appropriate targets for the development of novel therapies against staphylococcal infections.

Staphylococcus epidermidis é um estafilococo coagulase-negativo (ECN) que normalmente coloniza a pele e as mucosas do corpo humano, fazendo parte da sua microflora normal. No entanto, quando ocorre uma ruptura da superfície cutânea, por qualquer tipo de trauma ou inserção de um dispositivo médico, os estafilococos podem penetrar o hospedeiro, tornando-se patogénicos. Deste modo, nos últimos anos, S. epidermidis tornou-se um dos principais patogénicos nosocomiais associados a infecções de dispositivos médicos, nomeadamente, válvulas cardíacas, próteses para articulações, cateteres venosos centrais, cateteres urinários, lentes de contacto e próteses da anca. Os estafilococos aderem a esses dispositivos e desenvolvem biofilmes, o que constitui um importante factor de virulência e um dos mais relevantes mecanismos patogénicos de infecção estafilococal. Este trabalho de investigação teve como objectivo a avaliação da capacidade de adesão e formação de biofilme de várias estirpes de S. epidermidis a biomateriais utilizados no fabrico de dispositivos médicos. O estudo das propriedades de superfície que afectam a adesão bacteriana inicial, bem como formas de a prevenir constituíram também um dos objectivos propostos. Outra finalidade foi o estudo detalhado das propriedades de um biofilme maduro e das diferenças fenotípicas entre células sésseis e planctónicas. Os perfis proteicos da parede celular e da matriz extra-celular foram também um dos alvos de estudo, com o intuito de se aferir o papel destas proteínas na adesão e formação de biofilme. De modo a tentar correlacionar a capacidade de adesão das estirpes de S. epidermidis com as propriedades da superfície dos substratos (acrílico e silicone) e das células, a hidrofobicidade e os componentes de tensão superficial foram calculados através da medição de ângulos de contacto. A rugosidade superficial dos substratos foi avaliada por microscopia de força atómica (MFA). Desenvolveu-se um método expedito com o objectivo de se tentar reduzir a adesão de S. epidermidis a acrílico e a silicone por pré-condicionamento da superfície com heparina e violeta de genciana. Foram, também, efectuadas alterações na superfície de policarbonato, através do revestimento com ouro e a subsequente cobertura com diferentes monocamadas auto-organizadas (self-assembled monolayers - SAMs). A adesão foi realizada durante duas horas e o número de células aderidas foi determinado por enumeração directa, mediante microscopia de epifluorescência. No que diz respeito à formação de biofilme, testada em acrílico, a biomassa total foi quantificada por coloração com violeta de cristal. O número de células foi determinado por plaqueamento de unidades formadoras de colónias e a matriz extra-celular foi extraída pelo método da resina Dowex. O conteúdo da matriz, em termos de proteínas e polissacáridos, foi também quantificado. Estes resultados foram correlacionados com a actividade metabólica celular determinada pelos métodos de redução de XTT e determinação do consumo de glucose. A actividade metabólica de células planctónicas foi também avaliada pelos dois métodos. O perfil proteico dos extractos da parede celular e da matriz extra-celular das estirpes em estudo foi analisado por SDS-PAGE. Relativamente às propriedades da superfície celular (componentes de tensão superficial, grau de hidrofobicidade), não se verificaram diferenças significativas entre as estirpes testadas, excepto para a estirpe IE214, que apresentou um comportamento único de adesão. Não foi encontrada relação entre a hidrofobicidade da superfície celular e a capacidade de adesão. Porém, todas as estirpes aderiram melhor ao silicone, mais hidrofóbico e rugoso do que o acrílico, evidenciando a importância das propriedades de superfície do substrato na adesão inicial. Tanto a heparina como o violeta de genciana demonstraram ser eficazes na redução da adesão bacteriana, assim como o policarbonato coberto com ouro e as SAMs com grupos terminais metilo. Estes estudos apresentam significado clínico, dado que sugerem possíveis estratégias alternativas para a diminuição e prevenção da colonização bacteriana em superfícies de biomateriais. A análise da capacidade de formação de biofilme das várias estirpes de S. epidermidis estudadas, levou à confirmação de que a formação de biofilme, bem como a produção de polímeros extra-celulares são dependentes da estirpe e são factores de virulência associados à patogenicidade de algumas estirpes clínicas de S. epidermidis. Nos perfis proteicos da parede celular e da matriz extra-celular parecem estar presentes proteínas relacionadas com os processos de adesão e formação de biofilme, as quais são potenciais factores de virulência que devem ser tidos em consideração como alvos para o desenvolvimento de novas terapias contra infecções estafilococais.