Molecular determinants of glioma risk and patient prognisis

Abstract

Gliomas are a heterogeneous group of neoplasias that account for the majority of primary tumors of the central nervous system, of which glioblastoma multiforme is by far the most common and malignant subtype. These are particularly dramatic diseases, as gliomas rank first among all human tumor types for the tumor‐related average years of life lost, for which curative therapies are not yet available. Additionally, the etiology of gliomas and their clinically‐relevant prognostic factors are largely unknown. The research summarized in this thesis dealt primarily with molecular determinants of glioma risk and patient outcome, in an attempt to unveil some clues that may incrementally contribute to a better understanding of these tumors. Germ‐line genetic polymorphisms have been recently studied and implicated in susceptibility to human gliomas. We initiated our studies by investigating three singlenucleotide polymorphisms (SNPs) potentially relevant for glioma in the EGF/EGFR pathway, one of the most important growth signaling networks in gliomas: EGF+61 A/G, EGFR‐216 G/T, and EGFR‐191 C/A. Case‐control studies were conducted with Caucasian cancer‐free controls and glioma patients from Portugal. Our findings associate the EGF+61 G variant with increased risks for developing gliomas, particularly glioblastoma and oligodendroglioma. Notably, this is the first study implicating EGF+61 polymorphism in oligodendroglioma. In addition, we provide clear evidence that this SNP is functional, as the G allele is associated with increased promoter activity in a human glioma cell line, supporting the hypothesis that a constitutive lifetime exposure to higher levels of EGF may increase glioma risk. In contrast, our data do not support an association between EGFR ‐216 and ‐191 genetic variants and glioma risk. None of the tested polymorphisms was associated with survival of glioma patients in our data set. Nevertheless, their influence in the outcome of glioma patients, particularly those treated with EGFR‐targeting agents, is still debatable and lacking investigation. The clinical responses of glioblastoma patients are particularly poor and vary greatly among individual cases due to marked inter‐tumoral heterogeneity. Regardless, these patients are equally treated with a standardized therapeutic approach, mostly because wellestablished molecular prognostic markers are still lacking. Currently, the most promising molecular marker in glioblastoma is the methylation status of the MGMT gene promoter, but controversial findings have been reported, precluding its use in the clinical management of patients. We studied the prognostic potential of this marker in a set of Portuguese glioblastoma patients uniformly treated with temozolomide‐based chemoradiation. In our data set, similarly to other studies, patients whose tumors had a methylated MGMT promoter showed a trend for improved survival, but the differences failed to reach statistical significance. We additionally analyzed MGMT methylation in a set of North American glioblastoma patients treated with radiation and alkylating agent‐based chemotherapy and obtained similar results. We hypothesize that MGMT may be na important marker of glioblastoma patients’ outcome, but additional markers are necessary to improve the prognostication of these patients. In this context, we concluded our studies by investigating the prognostic capacity of HOXA genes in human glioblastomas. These genes encode crucial transcriptional regulators of embryonic development that have recently been shown to be altered in a wide variety of human tumors, but their relevance in glioblastoma has not been established. We implicate the reactivation of HOXA9 expression in glioblastoma as a novel, independent, and negative prognostic factor in three independent sets of North American glioblastoma patients (totalizing 107 cases). Additionally, HOXA9 reactivation was particularly frequent in a subgroup of glioblastoma with chromosomal domains of transcriptional aberrant HOXA gene activation. Importantly, we demonstrate the PI3K‐associated epigenetic mechanism by which this domain of activation is reversible, and provide functional data on the effects of HOXA9 in cell proliferation and apoptosis. Our findings have implications for therapies of glioblastoma patients targeting molecular players of the PI3K pathway, which are being extensively tested in clinical trials. In summary, the work summarized in this thesis discusses molecular characteristics that may influence the risk for human gliomas and patient outcomes. We hope our findings on the identification of EGF+61 as a risk factor for human gliomas and the implication of HOXA9 expression as an independent prognostic marker of glioblastoma patients may be modest but incremental contributions in the understanding of this devastating disease.

Os gliomas são os tumores primários mais frequentes do sistema nervoso central. Constituem um grupo heterogéneo de neoplasias, entre os quais o glioblastoma multiforme é, simultaneamente, o subtipo mais frequente e mais maligno. Os gliomas são neoplasias extremamente agressivas, apresentando a taxa mais elevada de “anos de vida perdidos” de entre todos os tipos tumorais humanos, e para os quais não existem tratamentos curativos. Além disso, a etiologia e os fatores de prognóstico destes tumores são praticamente desconhecidos. Os estudos sumarizados nesta tese incidiram particularmente em fatores moleculares associados ao risco para desenvolvimento de gliomas e fatores moleculares associados com o prognóstico clínico dos pacientes com gliomas. O papel de polimorfismos genéticos como fatores de risco para gliomas tem sido recentemente alvo de numerosos estudos. No nosso trabalho, começámos por investigar três polimorfismos genéticos da via de sinalização do EGF/EGFR, potencialmente relevantes para o risco de gliomas ‐ EGF+61 A/G, EGFR‐216 G/T, e EGFR‐191 C/A – através de estudos de caso‐controlo com indivíduos de origem Portuguesa. Os nossos resultados demonstraram que a variante genética G do polimorfismo EGF+61 está associada a um risco aumentado para o desenvolvimento de gliomas, particularmente glioblastomas e oligodendrogliomas. Este foi o primeiro estudo científico a demonstrar a importância deste polimorfismo para o risco de oligodendroglioma. Além disso, o nosso estudo clarificou o papel funcional deste polimorfismo, demonstrando que o alelo G está associado a uma maior atividade do promotor do gene EGF em linhas celulares humanas, sustentando a hipótese de que uma exposição continuada a maiores níveis de EGF pode aumentar o risco para o desenvolvimento de gliomas. Em contraste, os nossos resultados não demonstraram nenhuma associação entre as variantes genéticas dos polimorfismos EGFR ‐216 e ‐191 e risco de gliomas. Nenhum dos polimorfismos estudados estava correlacionado com a sobrevida dos pacientes na nossa amostra. Contudo, a influência destes polimorfismos genéticos na resposta de pacientes com glioma a terapias direcionadas especificamente à molécula EGFR é ainda desconhecida, e certamente merecedora de ser avaliada. As respostas clínicas dos pacientes com glioblastoma aos tratamentos atuais são particularmente insatisfatórias e bastante heterogéneas. Ainda assim, todos os pacientes são tratados com uma terapia uniformizada, em grande parte devido ao facto de não se conhecerem factores moleculares de prognóstico e preditivos da resposta terapêutica. Atualmente, o mais promissor fator molecular de prognóstico de glioblastomas e o estado de metilação do promotor do gene MGMT; no entanto, alguns resultados controversos têm impedido a sua aplicação clinica. Nos estudamos o valor prognóstico deste marcador num grupo de pacientes Portugueses com glioblastoma, tratados uniformemente com quimioradioterapia. Na nossa amostra, tal como noutros estudos, os pacientes com tumores que apresentam metilação do promotor do MGMT apresentavam uma tendência para uma melhor sobrevida, mas as diferenças não foram estatisticamente significativas. De igual modo, quando efetuamos esta mesma análise em pacientes Norte-Americanos, obtivemos os mesmos resultados. Deste modo, o MGMT poderá ser um biomarcador de prognostico de glioblastomas, mas e provável que existam outros biomarcadores igualmente relevantes na sobrevida destes pacientes. Numa tentativa de testar esta hipótese, investigamos a capacidade prognóstica dos genes HOXA em glioblastomas humanos. Estes genes codificam fatores de transcrição vitais no normal desenvolvimento embrionário, que estão alterados em diversos tumores; no entanto, a sua relevância em glioblastomas e desconhecida. Analisando pacientes Norte-Americanos com glioblastoma, nos demonstramos que a reativação da expressão do gene HOXA9 e um novo e independente marcador molecular preditivo de um pior prognostico destes pacientes. Alem disso, a expressão de HOXA9 foi particularmente frequente num subgrupo de glioblastomas que apresentava igualmente domínios cromossomicos de transcrição desregulada de genes HOXA. Por fim, demonstramos que a via PI3K regula um mecanismo epigenético associado a reativação da expressão do HOXA9, bem como clarificamos a sua importância funcional ao nível da proliferação celular e da apoptose. Em suma, esta tese discute características moleculares que podem influenciar o risco para o desenvolvimento de gliomas humanos e o prognóstico de pacientes com gliomas. Esperamos que a presente identificação do polimorfismo EGF+61 como um biomarcador de risco para o desenvolvimento de gliomas, e da expressão de HOXA9 como um biomarcador de prognóstico de glioblastoma, possam contribuir para um melhor conhecimento e abordagem clinica destes tumores devastadores.